地塞米松对CIA大鼠DRG中炎症因子的抑制和关节疼痛的改善作用

许冰馨，王琪珊，李 钦，范凯健，朱静艳，王婷玉

(上海交通大学医学院附属第九人民医院1.药剂科、2.药剂科静脉药物配置中心，上海 200011)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，常出现多个关节的持续性疼痛，严重时还可导致骨破坏、骨质侵蚀、关节畸形和功能丧失。长期的慢性关节疼痛常发生在手、足小关节中，是影响患者生存质量的重要因素。RA疼痛可能由不同病因造成，如外周炎症、中枢神经系统失调以及精神因素等。尽管目前对于RA疼痛的治疗有抗风湿药、镇痛药、抗抑郁药和抗癫痫药，但仍有许多患者的疼痛未能治愈[1]。因此，只有了解RA疼痛的根本原因，才能有效地进行疼痛治疗。

背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)是连接在脊髓背根两侧的膨胀结节，负责接收身体感受器的神经冲动，再将信号传递到脊髓。DRG在神经性疼痛的产生与持续中发挥重要作用，故研究DRG中与疼痛机制密切相关的离子通道及其受体、相关神经生长因子都是实现DRG靶向镇痛的关键[2]。

地塞米松(dexamethasone，DEX)属于长效的糖皮质激素，具有强大的抗炎、抗风湿和免疫抑制作用。现有临床数据表明，DEX可以迅速缓解RA患者关节肿胀和疼痛，减少骨侵蚀、降低炎症因子的表达，且治疗效果长久且安全[3]。虽然DEX联合抗风湿药物治疗的临床研究有很多，但是关于DEX治疗RA动物模型的DRG疼痛的作用机制的研究相对较少。故本文通过在Wistar大鼠上建立胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis， CIA)模型，并给予DEX(1 mg·kg-1)腹腔注射。通过观察大鼠后足机械痛阈改变、检测血清中炎症因子水平、检测DRG中炎症因子、疼痛相关的神经生长因子、离子通道受体表达水平的改变，来确定DEX对CIA大鼠疼痛与炎症的调节作用和潜在的机制。

1 材料

1.1 动物32只SPF级Wistar大鼠，♂，6～8周龄,体质量(160±20)g，购买和饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物中心。动物生产许可证编号：SCXK(沪)2013-0016，使用许可证编号：SYXK(沪)2016-0016。除10只正常组外，其余22只被随机、平均分成模型组和给药组，于温度(22±2)℃，相对湿度为50%～60%， 12 h明暗交替的通风环境中适应喂养1周。本实验已通过上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物伦理委员会批准。

1.2 试剂牛Ⅱ型胶原(Chondrex公司，批号170606)、弗氏不完全佐剂(Chondrex公司,170594)、地塞米松(Stemcell technologies, 批号BX27114)、TRIzol(美国Ambion公司，批号184608)。PCR引物(上海生工生物科技有限公司)、SYBR Green qPCR Master Mix(日本TaKaRa公司，批号522072)、大鼠IL-17A ELISA试剂盒(Multisciences公司，批号031780133)、大鼠TGF-β1 ELISA试剂盒(Multisciences公司，批号181711151)。

1.3 仪器旋涡混悬仪(海门其林贝尔，型号VORTEX-5)、离心机(德国Beckman,型号Microfuge 20R)、电子天平(上海浦春计量有限公司，型号JE2001)、实时定量PCR仪美国Thermo Scientific公司，型号7500)、酶标仪(澳大利亚Tecan公司，型号Infinite 200 Pro)、Von Frey纤维丝测痛仪(美国Danmic公司，型号Aesthesio)。

2 方法

2.1 CIA造模方法牛Ⅱ型胶原和弗氏不完全佐剂按照1 ∶1混匀成乳剂。d 0，将乳剂环绕多点注射于大鼠尾根部，每只注射乳剂0.1 mL。d 7，将相同乳剂以同样方式注射于大鼠尾根部，每只注射0.1 mL。

2.2 实验分组与给药方法将32只Wistar雄鼠分组。除正常组(NC组)10只外，其余大鼠造模成功后又随机平均分成模型组(Model组)和给药组(DEX组)。d 8开始，给药组腹腔注射地塞米松1 mg·kg-1，每周给药3次，连续给药4周。同时，正常组和模型组腹腔注射等体积生理盐水。

2.3 疼痛行为学测试造模后，每周2次，在明亮、安静环境下，使用Von-Frey测痛仪，通过up and down法[4]检测各组大鼠有后足机械性缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。先将每只大鼠置于底部为金属筛网的透明塑料笼内适应环境15 min，待其平静后，用Von Frey纤维丝从笼底垂直刺激大鼠后足底中部位置。当大鼠出现快速缩足即视作阳性反应，若时间大于5 s仍无缩足反应则视作阴性。每次间隔至少5 min，连续测3次，取平均值。根据Dixon公式计算50%缩足阈值。[50%缩足阈值=10(Xf+κδ)/10 000]Xf为末次刺激纤维丝力度的对数值，κ为不同刺激方式的系数，δ为各刺激力度取对数值后相邻间距的平均数。

2.4 ELISA法测定血清中炎症因子IL-17A和TGF-β1水平末次给药24 h后，将大鼠麻醉后经腹主动脉取血。离心(3 600 r·min-1×10 min)后将血清冻存于-80 ℃。试剂与血清样本平衡至室温后，按照ELISA试剂盒说明书检测步骤操作。使用酶标仪进行450 nm与630 nm双波长检测，根据标准曲线计算样本OD值。

2.5 Real-time PCR检测滑膜炎症因子mRNA的表达情况剥离大鼠后肢膝关节周围皮毛、筋膜与肌肉，剪开韧带并剥离髌下脂肪垫，用眼科剪刀取出大鼠滑膜组织。研碎后，TRIzol法提RNA，并在PCR扩增仪逆转录成cDNA。PCR扩增程序：95 ℃高温变性，60 ℃低温退火并延伸，共40个循环，65 ℃适温延伸[5]。引物序列见Tab 1。

2.6 Real-time PCR检测DRG相关炎症因子和疼痛指标NPY、NGF、BDNF、TRPV1的mRNA表达情况大鼠处死后，沿背部正中线剪开皮肤、分离脊柱侧边肌肉，咬骨钳或剪刀打开脊柱，分离脊髓后，在左右对称的椎间孔内可见淡黄色透明卵状的DRG[6]。取出L4-L6双侧DRG并研碎，TRIzol法提RNA，并在PCR扩增仪逆转录成cDNA。PCR扩增程序同2.5，引物序列见Tab 1。

3 结果

3.1 地塞米松对CIA大鼠MWT的影响造模初期，3组大鼠MWT没有明显差异。d12-19，模型组MWT值呈快速下降趋势，随后一直维持在较低水平。d19模型组MWT较正常组明显变小(P<0.01)，而地塞米松组较模型组明显升高(P<0.05)，见Fig 1。

Tab 1 Primer sequences in PCR

Fig 1 Measurement results of MWT of rats

3.2 地塞米松对CIA大鼠血清中炎症因子含量的影响连续给药4周后，取血清，采用ELISA方法对3组大鼠的促炎因子IL-17A、抗炎因子TGF-β1表达量分别进行检测。模型组IL-17A表达量明显高于正常组(P<0.01)，给药组IL-17A表达量较模型组有明显降低(P<0.05)。模型组TGF-β1表达量明显低于常组(P<0.05)，给药组TGF-β1表达量较模型组有明显升高(P<0.01)。表明地塞米松可以降低CIA大鼠血清中促炎因子表达量，同时提高抑炎因子的表达量，具有整体抗炎功效。见Fig 2。

3.3 地塞米松对滑膜中炎症因子mRNA表达的影响从Fig 3的Real-time PCR结果可见，相较正常组，模型组滑膜组织中的症因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α mRNA的相对表达量上升；给药组中这些炎症因子的相对表达量较模型组减少，差异均具有统计学意义。表明地塞米松具有抗炎作用，可以抑制滑膜中的炎症因子，减轻滑膜炎症。

3.4 地塞米松对DRG中炎症因子mRNA表达的影响从Fig 4A的Real-time PCR结果可见，相较正常组，模型组DRG中的症因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α mRNA的相对表达量上升；给药组中这些炎症因子的相对表达量较模型组减少，差异均具有统计学意义。表明地塞米松可以抑制DRG中炎症因子，具有抗炎作用。

Fig 2 Effect of dexamethasone on expression of IL-17A

Fig 3 Effect of dexamethasone on inflammatory factors

3.5 地塞米松对DRG中疼痛相关指标的影响从Fig 4B、4C的Real-time PCR结果可见，相对于正常组，模型组DRG中的疼痛相关的神经生长因子：神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)以及疼痛指标：瞬时感受器电位香草酸受体1(transient receptor potential vanilloid-1,TRPV1)的mRNA的相对表达量上升；而在给药组中NPY、NGF、BDNF、TRPV1的mRNA的相对表达量较模型组减少，差异均具有统计学意义。表明地塞米松可以抑制DRG中这些疼痛相关的受体和神经生长因子的含量，具有缓解疼痛的作用。

Fig 4 Effect of dexamethasone on mRNA expression of

4 讨论

RA是一类以滑膜炎为特征的自身免疫性疾病，常出现手足小关节滑膜炎、关节肿痛。晚期还会造成骨和软骨破坏、关节变形、疼痛加剧、劳动力丧失[7]。CIA和RA相似，均会出现炎症因子介导的组织损伤、滑膜炎症和关节疼痛变形。地塞米松是一类强效糖皮质激素，具有抗炎、抑制免疫和稳定神经膜的作用。临床常单独或联合其他镇痛药物用于治疗神经根病变、神经阻滞疼痛、神经炎性疼痛，术后疼痛，甚至是中重度癌症疼痛[8-9]。因此，本实验通过建立CIA大鼠模型，进一步研究DEX对于缓解CIA局部炎症和关节疼痛的作用机制。

炎症因子在机体内的含量也与疾病严重程度紧密相关。研究发现，炎症因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α在RA患者体内大量存在，会造成滑膜炎、关节软骨破坏和疼痛[2]。而TGF-β1则具有炎症抑制、免疫抑制作用和促进纤维细胞、成骨细胞增殖的作用，在RA中可以减少滑膜细胞增生、炎性细胞浸润、血管增生和肉芽组织的形成，对防止滑膜增生、浸润及关节破坏有重要作用[10]。局部注射TGF-β1不仅能促使伤口愈合，还能促进骨和软骨的修复。本实验通过ELISA法测得大鼠血清中致炎因子IL-17A的含量明显高于正常组大鼠，而抗炎因子TGF-β1的含量则低于正常组大鼠。在DEX治疗后，给药组血清内IL-17A含量较模型组下降明显，TGF-β1含量明显回升。说明DEX可以有效降低CIA大鼠血清内的炎症因子IL-17A，提高TGF-β1的作用，具有抑制整体促炎因子、增加抗炎因子，进而减少机体免疫应答、缓解局部滑膜炎症和增生的作用。

滑膜炎是RA基本病理改变之一。早期控制滑膜炎可以有效缓解病情，阻止关节破坏、僵硬变形，还能减少残疾的发生。PCR结果显示大鼠滑膜组织中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α的mRNA表达水平均高于正常组；而给药组的炎症因子水平较模型组均降低。说明地塞米松对膝关节滑膜组织的局部炎症可以起到明显的缓解作用。

DRG由脊髓神经节内的感觉神经元的轴突组成，对称地连接于在脊髓背根左右两侧。它作为痛觉传入神经元在疼痛调节机制中有非常重要的作用，在神经病理性疼痛的机制研究中具有重要意义。DRG中的炎症因子参与疼痛的形成，还会导致疼痛表达上调[11-12]。这些炎症因子不仅能引起急慢性疼痛、触诱发痛，还与神经源性痛紧密相关。本实验通过Real-time PCR法检测大鼠DRG中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α的mRNA的表达水平。结果显示，模型组大鼠炎症因子mRNA的表达量相较正常组均有不同程度的升高，而给药组较模型组炎症因子mRNA的表达量均有降低。表明地塞米松可以降低DRG中的炎症因子的表达，这可能也与给药后痛阈的降低有关。

NPY是存在于外周和中枢神经元中的一类内源性物质，参与疼痛调制。研究表明，脊髓Y1受体的激活和DRGY2受体的拮抗都能达到缓解机械痛的作用[13]。神经生长因子NGF可影响外周和中枢神经病理性疼痛，且NGF在RA患者的滑膜中含量与关节痛敏程度有关。动物实验证实，经过抗NGF治疗后疼痛得到明显缓解[14]。BDNF作为一类脑源性神经营养因子，与中枢神经的发育分化以及神经病理性疼痛紧密相关。多种疼痛动物模型中发现，阻断BDNF可以有效抑制痛敏现象的发生[15]。TRPV1在三叉神经节和DRG中均有表达，可参与慢性的外周和中枢敏感化，也与急性炎症痛敏相关，在热痛敏和机械痛敏起重要作用[16]。 本实验通过Real-time PCR法检测大鼠DRG中神经生长因子NPY、NGF、BDNF和疼痛相关的额离子通道受体TRPV1的mRNA 的表达水平。结果发现模型组大鼠的NPY、NGF、BDNF、TRPV1的mRNA的表达量较正常组均有不同程度的升高，而给药组较模型组均有降低。说明地塞米松可以有效降低CIA大鼠DRG中NPY、NGF、BDNF、TRPV1的表达，对调节CIA中的疼痛反应有很好疗效。

综上，地塞米松治疗CIA大鼠滑膜炎症和关节疼痛有明显的疗效。DEX可以降低CIA大鼠血清中促炎因子水平，同时提高促炎因子水平。此外，DEX还能通过改善滑膜内炎症因子和DRG中炎症因子、疼痛相关的神经生长因子NPY、NGF、BDNF以及香草酸受体TRPV1的水平以达到减轻滑膜炎症和缓解关节疼痛的治疗目的。