消乳散结胶囊灌胃对小鼠浆细胞性乳腺炎的治疗作用及其机制

刘洋，孙玉石，汤小江，何建军

西安交通大学第一附属医院，陕西西安710061

浆细胞性乳腺炎是一种慢性非感染性的乳腺炎症，多发于30-40岁的非哺乳期或绝经前期妇女[1]。浆细胞性乳腺炎病理特征为乳腺导管周围有大量浆细胞、淋巴细胞及少量中性粒细胞、多核巨细胞浸润，尤以浆细胞浸润为主[2]。浆细胞是由B淋巴细胞分化而来，并且浆细胞没有进一步增殖分化的能力，IL-6对浆细胞的分化和生存都有重要作用，它能通过IL-6/JAK2/STAT3通路使B细胞向浆细胞分化，还能诱导抗凋亡蛋白Bcl-2的产生从而抑制浆细胞凋亡。我们前期研究[3,4]结果表明，IL-6/JAK2/STAT3通路在浆细胞性乳腺炎发病过程中扮演重要作用。另外，我们在慢性乳腺炎的基础上给予IL-6激活IL-6/JAK2/STAT3通路成功建立小鼠浆细胞性乳腺炎模型[4]，这为我们在动物体内探索浆细胞性乳腺炎的有效治疗药物提供了可能。

现阶段浆细胞性乳腺炎的治疗主要是手术治疗，但术后很容易复发，这使得需要反复多次的手术，甚至有些患者最后不得不切除整个乳房[5]。另据国内外报道，浆细胞性乳腺炎发病率近年呈上升趋势，约占乳腺良性疾病的4%～5%[6]。但目前临床上没有明确有效地治疗此症的药物。消乳散结胶囊是临床上常见药，其不良反应较小，被广泛用于治疗乳腺增生症。但是,目前没有研究报道消乳散结胶囊是否对浆细胞性乳腺炎有治疗价值。2019年1月10日～2019年12月21日，本研究观察了消乳散结胶囊灌胃对浆细胞性乳腺炎小鼠的治疗作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 小鼠、试剂与仪器 6～8周龄、体质量18～20 g的Balb/c雌性小鼠购自西安交通大学实验动物中心并饲养于该中心。消乳散结胶囊购自山东步长神州制药有限公司。VCX-130超声波细胞粉粹机购自美国Sonics公司，光学显微镜购自日本Olympus公司，低温高速离心机购自德国Eppendorf公司。兔抗小鼠p-JAK2Y1007/1008单克隆抗体、兔抗小鼠CD138单克隆抗体购自英国Abcam公司；兔抗小鼠p-STAT3Y705单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司；兔抗小鼠Bcl-2多克隆抗体美国Bio-World公司；IL-6 ELISA试剂盒购自美国RayBiotech公司；完全弗氏佐剂购自美国Sigma公司；重组小鼠IL-6购自美国PeproTech公司。

1.2 浆细胞性乳腺炎小鼠模型制备、分组及消乳散结胶囊给予方法 取未污染的人体正常乳腺组织，与生理盐水以1∶3比例加入消毒的混匀机导管内，以中等速度混匀5 min(温度3～4 ℃)，在超声波细胞粉粹机中粉碎，然后储存于标本盒内；标本与同等体积的完全弗氏佐剂用注射器在4 ℃下重复混匀20 min，即制成混匀液。6～8周龄性成熟的雌性Balb/c小鼠用0.3%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，75%酒精消毒皮肤，在右侧第4对乳腺腺叶处皮下注射混匀液0.05 mL，观察3周，建立慢性乳腺炎模型，1周后在肿块周围皮下注射1 μg/mL小鼠重组IL-6蛋白0.05 mL，1周后浆细胞性乳腺炎小鼠模型造模完成[4]。将30只造模成功的小鼠随机分成消乳散结中剂量组、消乳散结高剂量组、生理盐水组，每组10只，消乳散结中剂量组、消乳散结高剂量组分别以50 mg/kg、100 mg/kg消乳散结胶囊灌胃，生理盐水组给予等量生理盐水灌胃，每日一次，连续治疗28 d后用于实验。

1.3 各组小鼠乳腺组织病理观察 取各组小鼠，用0.3%的水合氯醛腹腔注射麻醉，取乳腺肿块标本，切取部分组织用10%甲醛固定48 h，脱水、包埋、切片、脱蜡后，用伊红-苏木素染液染色，透明封固，最后中性树胶封片，于Olympus BX51显微镜下观察。

1.4 各组小鼠乳腺组织中CD138阳性浆细胞比例测算 取各组小鼠，用0.3%的水合氯醛腹腔注射麻醉，取乳腺肿块标本，切取部分组织用10%甲醛固定48 h，将石蜡切片脱蜡水化，3%的H2O2室温孵育20 min，将切片浸入10 mmol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)，煮沸后进行抗原修复，滴加稀释后的相应一抗(CD138抗体1∶500)，4℃过夜，滴加二抗室温下孵育，DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，氨水返蓝，中性树胶封固，晾干后镜下观察CD138阳性浆细胞数量，计算小鼠乳腺组织中CD138阳性浆细胞比例。CD138阳性浆细胞比例=CD138阳性浆细胞数量/镜下细胞总数×100%。

1.5 各组小鼠乳腺组织匀浆液中IL-6检测 采用ELISA法。取各组小鼠，用0.3%的水合氯醛腹腔注射麻醉，取乳腺肿块标本，液氮速冻后，压碎成直径小于2 mm的碎片，称重，按照重量∶体积=1∶7的比例用PBS重悬组织碎片，并于4 ℃涡旋震荡2 h，5 000 r/min离心3 min，收集上清至新EP管即为组织匀浆液，按照RayBiotech公司Mouse IL-6 ELISA试剂盒说明书步骤检测小鼠乳腺组织匀浆液中IL-6。

1.6 各组小鼠乳腺组织中p-JAK2Y1007/1008、p-STAT3Y705染色阳性细胞比例测算 取各组小鼠，用0.3%的水合氯醛腹腔注射麻醉，取乳腺肿块标本，切取部分组织用10%甲醛固定48 h，将石蜡切片脱蜡水化，3%的H2O2室温孵育20 min，将切片浸入1 mmol/L的Tris/EDTA抗原修复液(pH 9.0)煮沸后进行抗原修复，滴加稀释后的相应一抗(p-JAK2Y1007/1008抗体1∶200，p-STAT3Y705抗体1∶200)，4 ℃过夜，滴加二抗室温下孵育，DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，氨水返蓝，中性树胶封固，晾干后镜下观察p-JAK2Y1007/1008、p-STAT3Y705染色阳性细胞数量，计算小鼠乳腺组织中p-JAK2Y1007/1008、p-STAT3Y705染色阳性细胞比例。p-JAK2Y1007/1008阳性浆细胞比例=p-JAK2Y1007/1008阳性浆细胞数量/镜下细胞总数×100%。p-STAT3Y705阳性浆细胞比例=p-STAT3Y705阳性浆细胞数量/镜下细胞总数×100%。

1.7 各组小鼠乳腺组织中Bcl-2组化评分测算 取各组小鼠，用0.3%的水合氯醛腹腔注射麻醉，取乳腺肿块标本，切取部分组织用10%甲醛固定48 h，将石蜡切片脱蜡水化，3%的H2O2室温孵育20 min，将切片浸入10 mmol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)，煮沸后进行抗原修复，滴加稀释后的相应一抗(Bcl-2抗体1∶100)，4℃过夜，滴加二抗室温下孵育，DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，氨水返蓝，中性树胶封固，晾干后镜下观察并进行组化评分：每张切片在40×10倍光镜下随机选取炎症区内5个不重叠的视野，依据阳性细胞百分比(无阳性细胞记0分、阳性细胞比≤25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、>75%为4分)与染色强度(无表达为0分、淡黄为1分、棕黄为2分、棕褐为3分)分别计分，两项得分相乘为该视野的评分，最后求5个视野的平均值即为最终评分[3]。

2 结果

2.1 各组小鼠乳腺组织病理变化 治疗结束后，各组小鼠乳腺组织都可见腺泡结构紊乱，腺泡周围有大量的炎症细胞，尤以浆细胞、淋巴细胞为主，还包括中性粒细胞，其中消乳散结高剂量组较生理盐水组炎性细胞包括浆细胞、淋巴细胞数量更少(图1)。

图1 各组小鼠乳腺组织HE染色(400×)

2.2 各组小鼠乳腺组织中CD138阳性浆细胞比例比较 消乳散结高剂量组小鼠乳腺组织中CD138阳性浆细胞比例为11.30%±2.79%，消乳散结中剂量组为18.4%±3.37%，生理盐水组为21.80%±4.71%，其中消乳散结高剂量组小鼠乳腺组织中CD138阳性浆细胞比例与生理盐水组相比，P<0.05。

2.3 各组小鼠乳腺组织匀浆液中IL-6表达水平比较 消乳散结高剂量组小鼠乳腺组织匀浆液中IL-6表达水平为(385.99±24.06)pg/mL，消乳散结中剂量组为(404.17±21.72)pg/mL，生理盐水组为(425.86±33.92)pg/mL，其中消乳散结高剂量组小鼠乳腺组织匀浆液中IL-6表达水平与生理盐水组相比，P<0.05。

2.4 各组小鼠乳腺组织中p-JAK2Y1007/1008、p-STAT3Y705染色阳性细胞比例比较 消乳散结高剂量组小鼠乳腺组织中p-JAK2Y1007/1008、p-STAT3Y705染色阳性细胞比例分别为6.80%±2.53%、8.4%±2.72%，消乳散结中剂量组为13.2%±6.58%、14.2%±4.39%，生理盐水组为16.30%±4.72%、17%±2.94%，其中消乳散结高剂量组小鼠乳腺组织中p-JAK2Y1007/1008、p-STAT3Y705染色阳性细胞比例与生理盐水组相比，P均<0.05。

2.5 各组小鼠乳腺组织中Bcl-2组化评分比较 消乳散结高剂量组小鼠乳腺组织中Bcl-2组化评分为(2.7±1.49)分，消乳散结中剂量组为(3.5±1.51)分，生理盐水组为(4.8±1.87)分，其中消乳散结高剂量组小鼠乳腺组织中Bcl-2组化评分与生理盐水组相比，P<0.05。

3 讨论

浆细胞性乳腺炎是一种好发于中青年女性的慢性非细菌性乳腺炎症，其发病率近年呈上升趋势[6]。浆细胞性乳腺炎临床上主要依靠手术治疗[7]，但是术后容易复发，也容易形成乳管瘘，经久不愈，需要反复多次的手术，形成很多的伤疤，甚至有些患者最后不得不切除整个乳房，对患者的身体和精神带来极大的伤害。尽管部分患者抗结核治疗有一定效果，但是抗结核药不良反应明显[8]。目前临床缺乏有效地治疗此病的药物。本研究首次探索临床上常用的消乳散结胶囊对小鼠浆细胞性乳腺炎的治疗作用，我们发现高剂量消乳散结胶囊组炎症程度有明显的改善、浆细胞数量都有明显的减少。

浆细胞性乳腺炎最主要的特征是导管周围有大量的浆细胞聚集[9]，本研究发现消乳散结胶囊高剂量组CD138阳性浆细胞明显减少，提示消乳散结胶囊可能对浆细胞性乳腺炎小鼠有一定的治疗作用。浆细胞是重要的免疫细胞，它由B淋巴细胞分化发育而来，浆细胞正常情况下寿命较短[10-11]。IL-6是一种多功能的细胞因子，在B淋巴细胞中，IL-6能通过IL-6/JAK2/STAT3通路激活STAT3[12]，STAT3激活后可以诱导XBP-1的表达，进而促使B淋巴细胞向浆细胞分化[13]。有研究[14]发现，XBP-1参与控制IL-6的生成，在浆细胞大量产生的过程中也产生大量的IL-6。IL-6也是维持浆细胞和淋巴细胞生存的最重要的细胞因子[14-15]。我们的前期实验[3-4]已经证明，IL-6/JAK2/STAT3通路在浆细胞性乳腺炎发病过程中扮演重要的作用。在本研究中，ELISA结果显示消乳散结胶囊高剂量组小鼠乳腺组织匀浆液中IL-6明显减少，免疫组化结果也显示消乳散结胶囊高剂量组小鼠乳腺组织中p-JAK2Y1007/1008、p-STAT3Y705表达明显减少，这些结果都表明高剂量消乳散结胶囊对浆细胞性乳腺炎小鼠模型中的IL-6/JAK2/STAT3通路有一定程度的抑制作用。

Bcl-2是IL-6/JAK2/STAT3通路的靶基因[15]。在前期实验中我们发现，浆细胞性乳腺炎小鼠模型和浆细胞性乳腺炎患者乳腺组织中的浆细胞上都有大量的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，这种抗凋亡能力增强的浆细胞在很多疾病中扮演重要作用[16]。在本研究中我们发现，消乳散结高剂量组中Bcl-2的表达显著的下降，这说明高剂量的消乳散结胶囊能通过抑制IL-6/JAK2/STAT3通路的活性，减少Bcl-2的表达，进一步减少组织中的浆细胞，最终抑制病情的进展。

综上，高剂量的消乳散结胶囊(100 mg/kg)对小鼠浆细胞性乳腺炎有一定的治疗作用，高剂量的消乳散结胶囊可能通过抑制IL-6/JAK2/STAT3通路的活性，减少组织中IL-6的产生，减少浆细胞的产生并抑制其抗凋亡的作用，减少组织中浆细胞的聚集，从而抑制浆细胞性乳腺炎的进展，最终达到治疗的效果，这为消乳散结胶囊的临床应用于治疗浆细胞性乳腺炎提供了一定的理论支持，不过还需要进一步的临床试验去验证。