肺神经内分泌肿瘤发生发展过程中相关基因、微小RNA、信号通路的调控作用研究进展

耿僡临，胡鹏程，翁艳

清华大学第一附属医院，北京100016

肺神经内分泌肿瘤是具有共同神经内分泌分化的肺肿瘤的一个亚型，包括典型和非典型类癌、小细胞肺癌和大细胞神经内分泌癌，其形态学、免疫组织化学和分子特征均不同，临床和生物学行为也有很大差异。典型类癌呈低度恶性，非典型类癌中度恶性，小细胞肺癌和大细胞神经内分泌癌高度恶性，无论是从病理学、遗传学或临床表现上，都难以明确区分[1-2]。肺神经内分泌肿瘤的发生发展与许多因素有关，目前研究较多的主要涉及基因、微小RNA、信号通路等。现将肺神经内分泌肿瘤发生发展过程中相关基因、微小RNA、信号通路的调控作用研究进展综述如下。

1 肺神经内分泌肿瘤发生发展过程中相关基因的调控作用

肺神经内分泌肿瘤发生发展过程中起调控作用的相关基因主要有细胞周期调控基因、染色质重构基因、Yes相关蛋白1(YAP1)基因、MYC家族基因、BCL2家族基因、p130基因。

1.1 肺神经内分泌肿瘤发生发展过程中细胞周期调控基因的调控作用 在肺的神经内分泌肿瘤中，细胞周期调控基因RB1和TP53在癌中的突变明显高于类癌。RB1基因在所有的肺神经内分泌肿瘤中均有缺失，主要见于小细胞肺癌和大细胞神经内分泌癌。TP53基因的缺失在肺高级别神经内分泌肿瘤中很常见，在类癌中很少出现[4]。在大细胞神经内分泌癌中，TP53和RB1基因缺失率也较高，但RB1基因的缺失频率低于小细胞肺癌[5]。小细胞肺癌具有典型的RB1和TP53基因突变，RB1双等位基因缺失在小细胞肺癌或鳞状细胞癌患者中常见。在体外ASCL1(achaete-scute complex-like 1)基因克隆中，RB通过三个不同位点的丝氨酸广泛磷酸化而失活。RB基因失活后，E2F1因子被释放，引导p53介导的细胞凋亡。因此，Ser795磷酸化具有重要的功能，因为它是抑制E2F1与RB结合的最有效位点。肿瘤细胞可以通过获得TP53基因突变来规避这一机制。在细胞周期中，细胞周期依赖性蛋白激酶(CDKs)介导RB的磷酸化。在ASCL1过表达时，CDK5表达上调，ASCL1和CDK5在肺癌细胞中存在直接相互作用，ASCL1通过活化的CDK5刺激细胞迁移，CDK5能够在有丝分裂后的神经元中使RB磷酸化，使细胞周期重新进入和增殖。我们发现，ASCL1过表达导致CD56在体外表达，在小细胞肺癌中，ASCL1表达可能与RB和p53缺失共同存在，RB1基因缺失与神经内分泌分化的增殖增高和NOTCH基因突变失活有直接关系[6]。

1.2 肺神经内分泌肿瘤发生发展过程中染色质重构基因的调控作用 染色质重构基因在肿瘤发生中起着关键作用，这些基因的突变是肺类癌发生的一个驱动因素。染色质重构基因包括内共价组蛋白修饰因子和SWI-SNF复合物亚基，是目前发现的在肺的类癌和癌中突变率最高的基因组。研究[4]表明，KMT2基因家族共价组蛋白修饰因子(KMT2A、KMT2C和KMT2D)和SWI-SNF复合物(ARID1A、ARID1B和ARID2)在类癌和癌中突变率相近。另有研究[7]表明，染色质修饰因子是所有肺神经内分泌肿瘤发病机制中的主要参与者，在类癌中的作用可能更为明显，因为类癌具有低突变背景，而神经内分泌癌则具有高突变背景和特征性的细胞周期调控基因TP53和RB1缺失。最常见的突变基因是MEN1、PSIP1和SFRS1相互作用蛋白1、ARID1A。类癌细胞中MEN1、PSIP1和ARID1A常发生基因突变，MEN1基因突变几乎只存在于类癌中[4,7]。在另一项研究中，KMT2D在8%的小细胞肺癌肿瘤组织和17%的小细胞肺癌细胞系中出现无义/移码/剪接位点突变。小细胞肺癌细胞系中的这些突变与赖氨酸甲基转移酶2D蛋白水平降低和组蛋白H3赖氨酸-4的单甲基化降低有关，而单甲基化降低与转录因子增强有关[8]。在生存分析中，MEN1突变与非典型类癌的预后不良相关，KMT2D与小细胞肺癌的预后具有相关性，小细胞肺癌患者KMT2D的突变与较长的生存期相关[4]。

1.3 肺神经内分泌肿瘤发生发展过程中YAP1基因的调控作用 YAP1基因是Hippo通路中与肺癌发病相关的癌基因，可作为新的神经内分泌标志物，对肺神经内分泌肿瘤的治疗具有潜在的预测作用。YAP1基因的缺失与神经内分泌标志物的强表达有关。ASCL1的表达可能导致YAP1的缺失，ASCL1通过激活miR375对YAP1的下调，抑制了细胞凋亡。RAB3A是一种突触囊泡特异性蛋白，在正常神经内分泌细胞和恶性神经内分泌肿瘤中特异性表达，而YAP1基因的缺失诱导了神经内分泌标志物RAB3A的表达，提示YAP1基因参与了神经内分泌分化的调控。YAP1基因缺失的神经内分泌肿瘤可能是高级别神经内分泌肿瘤的一个独特的亚型，这些肿瘤强表达神经内分泌标志物，对化疗敏感，因此，检测YAP1基因的表达可将高级别神经内分泌肿瘤分为化疗敏感性和抗药性两种类型。在YAP1阳性的高级别神经内分泌肿瘤中，出现药物不良反应的程度可能超过铂类化疗的治疗效果。然而，YAP1基因的缺失不是高级别神经内分泌肿瘤特有的，而在所有的神经内分泌肿瘤中均常见。近年来，YAP1基因也作为检测各种肿瘤对铂类药物耐药性的重要标志物，包括非小细胞肺癌、口腔癌、宫颈癌、甲状腺癌和卵巢癌[9]。

1.4 肺神经内分泌肿瘤发生发展过程中MYC家族基因的调控作用 MYC家族基因包括MYC、MYCL和MYCN，是在小细胞肺癌中反复出现异常的致癌基因，可作为小细胞肺癌新的治疗靶点。MYC家族成员是基本螺旋-环-螺旋(bHLH)亮氨酸拉链转录因子，与标准E-box DNA元件CACGTG结合，与bHLH小蛋白MAX以异源二聚体的形式激活靶基因表达。MYC家族成员具有高度保守的结构域，如启动转录机制的反式激活结构域、E-box特异性DNA结合的基本结构域、参与蛋白质周转和功能调控的MYC同源盒(MB)以及参与MAX二聚体化的C-末端HLH-亮氨酸拉链结构域。MYC家族成员个体的扩增与小细胞肺癌的表型差异有关。研究[10]表明，不同的MYC家族成员决定了肿瘤对Aurora激酶(AURK)抑制剂阿利泽替布的敏感性，其中MYC扩增的小细胞肺癌细胞最敏感。另外，最近研究的CHK1抑制剂是另一个药物靶点，MYC扩增的小细胞肺癌对CHK1抑制更加敏感，表明MYC的状态是小细胞肺癌治疗反应的重要决定因素。MYC通过几种机制激活基因转录，包括基础转录因子、组蛋白乙酰化酶、染色质重塑和RNA聚合酶的增加。MYC完全扩增现有基因的表达模式，而不是专门诱导一组不同的靶基因，因此，不同细胞类型之间MYC效应存在差异。除了转录作用外，MYC还通过与复制起始复合体相互作用，促进CDC45的表达，MYC的过表达诱导激活DNA损伤反应，导致基因组不稳定性增加。CDK7是一种能磷酸化Pol Ⅱ的周期蛋白依赖性激酶，是小细胞肺癌的一种新的治疗靶点，与非小细胞肺癌相比，小细胞肺癌对CDK7抑制剂THZ1的敏感性增加，因为CDK7抑制剂作用于调节MYC家族成员的小细胞肺癌特异性增强子，导致MYC和MYCN水平下降。在小细胞肺癌的细胞系中发现了MYCL两种差异显著的转录表达，短亚型缺乏HLH结构域；MYCL的过表达结合Trp53和RB1的缺失，可显著降低肿瘤潜伏期，促进了高侵袭性、高转移性的肿瘤，这些肿瘤最初对化疗敏感，随后易复发。然而，MYCL基因的缺失明显抑制肿瘤的形成，导致混合型和非小细胞肺癌的形态学改变，表明MYCL除了促进增殖外，还可能在小细胞肺癌的分化中发挥作用。MYCN在小细胞肺癌患者和小细胞肺癌细胞系出现扩增，但尚未明确其与经典或变异型组织病理学形态以及治疗反应的关系[10-11]。

1.5 肺神经内分泌肿瘤发生发展过程中BCL2家族基因的调控作用 逃避细胞凋亡是癌症的特征，BCL2家族成员如BCL2相关的BAX和BCL2，通过促进或阻碍细胞凋亡积极参与这个过程。研究[3]表明，在肺的大细胞神经内分泌癌中，BCL2表达高，而在小细胞肺癌中，磷酸化的BCL2(pBCL2)表达高，在类癌中均呈低表达，BCL2在类癌组织中的表达明显低于癌组织。在另一项研究[12]中，BCL2/BAX比值在典型和非典型类癌、小细胞肺癌和大细胞神经内分泌癌中均有增加。较高的pBCL2水平与肺神经内分泌癌患者的无进展生存率和总生存率呈负相关[3,12]。

1.6 肺神经内分泌肿瘤发生发展过程中p130基因的调控作用 p130基因是细胞周期调控因子，引导检测体内双重突变和三重突变肿瘤细胞的增殖状态。细胞周期标志物Ki-67和S期标志物PCNA、MCM6的免疫组化染色显示，双重突变体细胞和三重突变体细胞均增殖活跃。在小细胞肺癌中，p130通过限制Rb/p53突变细胞的增殖而抑制肿瘤生长，起到关键的抑癌作用。p130功能的丧失导致小细胞肺癌细胞增殖增加，在Rb和p53基因缺失的情况下，p130基因的缺失加速了肿瘤的发展，并保持了小细胞肺癌的组织病理学特征和分子特征。Rb/p53/p130联合突变为寻找治疗小细胞肺癌的新靶点提供了临床思路[13]。

2 肺神经内分泌肿瘤发生发展过程中相关miRNA的调控作用

miRNAs是短的、非编码的、高度保守的单链RNA，具有转录后调控功能，抑制基因表达，调控细胞增殖、分化和凋亡[14]。miRNAs在肺癌发生、上皮间质转化和治疗中具有重要作用，其易检测，具有极高的特异性，在切除的肿瘤标本或细针穿刺标本中测量的miRNAs已经成为肿瘤诊断、预测预后和治疗反应的有效生物标志物[15]。特异性miRNAs的表达分析对肺神经内分泌肿瘤具有诊断和/或预测价值。肺神经内分泌肿瘤的不同亚型在miRNAs表达谱上有显著差异[16]。研究[17]显示，miR375主要来源于肾上腺、甲状腺、肺和肠黏膜的神经内分泌细胞，miR375-3p能诱导神经内分泌细胞分化；肺低级别神经内分泌肿瘤组织中miR375-3p水平高于肺非神经内分泌肿瘤组织，然而，miR375-3尚不能区分不同类型的肺神经内分泌肿瘤。miR205-5p在鉴别肺腺癌和鳞状细胞癌中有一定价值，然而，在鉴别其他类型的肺肿瘤(如神经内分泌肿瘤)中miR205-5p的诊断价值尚不明确[17]。研究[16]显示，miR-22、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-367、miR-504、miR-513C、miR-1200、miR-18a、miR-15b、miR-335、miR-1201与肿瘤生物学分级呈负相关，miRNAs let-7d、miR-19、miR-576-5p、miR-340、miR-1286与患者的生存期显著相关，miR-29家族的成员在肺神经内分泌肿瘤中有极其重要的作用。

3 肺神经内分泌肿瘤发生发展过程中相关信号通路的调控作用

3.1 肺神经内分泌肿瘤发生发展过程中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的调控作用 哺乳动物mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/p70S6K信号通路中的主要蛋白激酶，它从氨基酸、营养物质、生长因子和环境因子中获取信息，调节各种基本细胞过程，包括蛋白质合成、生长、代谢、衰老、再生、自噬等，参与细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤发生和血管生成[1]，在包括神经内分泌肿瘤在内的多种肿瘤中都发现了mTOR和mTOR相关激酶的正常活性改变和mTOR信号通路的失调。mTOR在癌中常被激活[18]，为肿瘤治疗提供了一个潜在靶点。mTOR抑制剂是一种常用的免疫抑制剂，如依维莫司，已应用于胰腺神经内分泌肿瘤的治疗中，最近的临床试验结果表明mTOR抑制剂在类癌的治疗中也有价值[19]。mTOR蛋白由两个不同的多亚基复合体mTORC1与mTORC2组成。mTORC1复合体被多种刺激因素激活，如生长因子、营养物质、能量、应激信号以及重要的信号通路(如PI3K和MAPK)，从而控制细胞的生长和增殖。mTORC1也能激活S6K1和4EBP1这两种蛋白参与mRNA的翻译。mTORC2复合物抵抗雷帕霉素的抑制活性，对营养依赖和能量依赖信号通常不敏感，它能激活PKC-α和Akt，并调节肌动蛋白细胞骨架。mTOR信号通路的异常在癌中常见，包括PI3K扩增/突变、PTEN功能丧失、Akt过表达，S6K1、4EBP1和eIF4E过表达。mTOR信号通路成分表达的改变在肿瘤进展中起着重要作用[20]。mTOR信号通路的异常与神经内分泌肿瘤的发生密切相关，在神经内分泌肿瘤中也存在mTOR通路成分表达的改变，并与临床预后有关。针对mTOR通路的治疗已成为一种有效的治疗策略，使用mTOR抑制剂依维莫司治疗胰腺神经内分泌肿瘤与改善患者的无进展生存期(PFS)有关。尽管依维莫司可以减缓肿瘤的进展，但显著的肿瘤减少较少见。针对多种信号通路异常的治疗是一种治疗策略，可以提供更好的肿瘤控制和克服与单一途径相关的耐药机制，使用mTOR抑制剂与其他靶向药物，如VEGF通路抑制剂和细胞毒性化疗联合治疗晚期神经内分泌肿瘤有更好的效果[21]。生长抑素受体2、多巴胺受体2和p70S6K(非磷酸化和磷酸化)蛋白在大多数典型肺类癌组织中表达。单独使用奥曲肽和卡麦角林并不足以阻断细胞活性，但这两种药物与mTOR抑制剂联合使用可减少mTOR抑制剂诱导的逃逸机制，激活内源性mTOR抑制，增强mTOR抑制剂在典型肺类癌中的作用[22]。大多数支气管肺神经内分泌肿瘤(BP-NETs)表达p-AKT和p-mTOR，提示AKT/mTOR通路在这些肿瘤中起重要作用[23]。除总mTOR水平外，反映支气管类癌对mTOR抑制剂敏感性的标记物还包括AKT、p70S6K(RPS6KB2)和ERK1/2(MAPK3/1)蛋白水平，表明双重PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235在抑制支气管类癌细胞增殖方面比依维莫司更有效，“耐药”细胞表现出较低的mTOR、p70S6K、AKT和ERK1/2水平，表明这些蛋白质可以作为人类支气管类癌中对mTOR和PI3K/mTOR抑制剂耐药性的预测标志物[24]。在小细胞肺癌中检测到PI3K-AKT-mTOR信号通路编码基因的高频率基因拷贝数改变。在肺神经内分泌肿瘤的AKT和mTOR表达的免疫组化研究中，大多数病例发现了磷酸化AKT和mTOR，提示这种途径在致神经内分泌肿瘤中起着核心作用，这些分子在类癌中的表达高于小细胞肺癌和大细胞神经内分泌癌。mTOR的表达与小细胞肺癌和大细胞神经内分泌癌的肿瘤分期呈负相关，T1-T2期肿瘤的mTOR磷酸化水平高于T3-T4期肿瘤。高级别和更具侵略性的神经内分泌肿瘤具有不同于低级别和中级别肿瘤的分子特征，肺大细胞神经内分泌癌具有与小细胞肺癌相似的基因组特征，包括潜在的治疗靶点，如PI3K/AKT/mTOR通路和其他基因改变，具有诊断和治疗的临床意义[5, 25]。针对mTOR通路的靶向治疗是一种可行的治疗策略。雷帕霉素在体外(BON-1、H727和MTC细胞系)和BON-1异种移植模型中均具有减少类癌增殖的作用。在人类原发性支气管类癌细胞培养中，依维莫司已被证明可以减少血管内皮生长因子的分泌和细胞活性。在小细胞肺癌细胞中，真核起始因子4E(elF4E)的高表达与增强对依维莫司治疗的耐药性有关。由MYC介导的elF4E信号转导通路与mTOR的激活是一种促进依维莫司耐药的机制，并为其抑制作用的进一步研究提供了理论基础[26]。

3.2 肺神经内分泌肿瘤发生发展过程中NOTCH信号通路的调控作用 NOTCH受体在某些情况下可以作为癌基因，在另一些情况下可以作为抑癌基因[27]。NOTCH1信号通路在细胞周期转运中起重要作用，参与呼吸系统和胃肠道细胞的神经内分泌分化。NOTCH1调节类癌细胞生长和神经内分泌表型[28]。研究[29]表明，NOTCH1信号通路通常不存在于神经内分泌肿瘤中，而NOTCH1信号通路的激活可以显著减少肿瘤的生长。重新激活NOTCH信号通路可能是小细胞肺癌患者的一种治疗策略。ASCL1是NOTCH信号通路抑制的靶点，神经内分泌肿瘤(包括小细胞肺癌)中ASCL1的表达增加，促进肿瘤生长，而NOTCH1信号通路降低了这种表达。ASCL1对高级别神经内分泌肿瘤的特异性高于类癌。一个失活的NOTCH突变足以诱导非神经内分泌肿瘤细胞或肿瘤前体细胞向神经内分泌分化。然而，多个NOTCH受体失活增加了原发性小细胞肺癌的可能性。NOTCH信号通路失活，随后ASCL1上调，RB1和TP53的同时突变放大激活Wnt级联，促进了继发性小细胞肺癌。在小细胞肺癌中，NOTCH1通路失活上调导致细胞生长抑制和神经内皮细胞分化，并诱导细胞系出现上皮样形态[6,26]。ASCL1还调节NOTCH通路中的多个基因，包括DLL3[30]。NOTCH信号通路中的另一成员，NOTCH3信号在肺癌中的表达依赖于细胞类型。研究[31]显示，NOTCH3在小细胞肺癌中表现为肿瘤抑制通路，而在非小细胞肺癌中表现为肿瘤促进通路。

综上所述，肺神经内分泌肿瘤发生发展过程受细胞周期调控基因、染色质重构基因、YAP1基因、MYC家族、BCL2家族、p130基因，肿瘤相关的miRNAs以及肿瘤相关的通路(mTOR信号通路、NOTCH信号通路)的调控，这些分子靶点在临床诊断和治疗上均有重要作用。但这些研究还尚未完善，因此，还需更大量的肺神经内分泌肿瘤的分子生物学研究，进行相关的临床试验，进一步探索分子靶点在肿瘤诊断、治疗及预后中的作用，为肺神经内分泌肿瘤的病理学分型及临床靶向治疗提供更准确、更有效的依据。