一氧化氮前体类药物在肿瘤治疗中的应用及作用机制研究进展

林善鸿，曾文锋，赵玉婉，吴昊开，柳建军

广东医科大学附属医院，广东湛江524001

一氧化氮(NO)是一种具有高度扩散性和反应性的分子，能够作为信使参与细胞内和细胞间多种重要的生理活动。研究[1-2]表明，低浓度的NO可通过增强血管新生能力的方式促进肿瘤的发生发展，而高浓度的NO则对肿瘤细胞具有明显的肿瘤抑制作用。但NO属于气体分子，其半衰期较短，且具有水溶性低、极易扩散等特点，临床应用困难。因此，可释放NO的NO前体药物受到广泛关注，有关NO前体类药物在肿瘤治疗中的应用及作用机制研究也较多，现综述如下。

1 NO的生理特点及其对肿瘤发生发展的调控作用

NO是在生物体内一种具有信号传导作用的气体信号分子，是由L-精氨酸在NO合成酶(NOS)及其他辅助因子如烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)以及(6R-)5,6,7,8-四氢生物蝶呤(BH4)的参与下催化产生的[3]。NOS可分为神经元型NOS(nNOS)、诱导型NOS(iNOS)和内皮型NOS(eNOS)3种亚型，其中nNOS和eNOS主要受细胞内钙离子水平依赖性调控，而iNOS受钙离子非依赖性调控，并可在炎症细胞因子、氧化应激反应等作用下迅速在局部产生高水平的NO[4]。有研究[5]表明，虽然不同亚型的NOS在不同的肿瘤细胞中的表达有所差异，但是NOS表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关，尤其是iNOS的过表达。NO是肿瘤生长过程中许多转录因子和信号级联反应的重要介质。在肿瘤细胞内，低水平浓度的NO可促进肿瘤血管的新生、抑制细胞发生凋亡，而高水平浓度的NO则主要通过促凋亡的机制发挥出抗肿瘤的活性[6]。目前利用NO治疗肿瘤研究主要存在两个方面的困难。一方面，在物理性质上，NO属于气体分子，其半衰期较低，且具有水溶性低、极易扩散等特点[7]，临床试验困难诸多。另一方面，不同浓度的NO对不同肿瘤的作用效果不尽相同，精确研究出不同肿瘤各自合适的NO浓度十分困难。

2 NO前体药物在肿瘤治疗中的应用及作用机制

目前引起广泛关注的NO前体药物包括有机硝酸酯类、金属-亚硝基复合物类、呋咱氮类、S-亚硝基硫醇类、重氮烯二酸盐类和释放NO的聚合体纳米颗粒(NPs)等，它们通过引起肿瘤细胞内活性氧和活性氮积累，导致线粒体损伤进而诱导肿瘤细胞发生凋亡，也可通过诱导肿瘤细胞发生周期阻滞、损伤DNA、增强肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性、改善肿瘤细胞对化疗药物的耐药性等途径，提高肿瘤治疗效果。

2.1 有机硝酸酯类药物在肿瘤治疗中的应用及作用机制 有机硝酸酯类药物在临床上主要用于缓解快速可逆性的急性心绞痛，也可用于治疗心力衰竭。研究[8]发现，有机硝酸酯类药物在谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、细胞色素P450还原酶、黄嘌呤氧化还原酶和醛脱氢酶共同催化作用下可转化为NO，从而发挥其生理作用，其最主要的代表药物是硝酸甘油(GTN)。GTN为代表的有机硝酸酯类NO前体药通过不同的机制在一定程度上具有抗肿瘤的重要作用。GTN可通过释放NO，改善肿瘤组织缺氧微环境的血流情况并减少缺氧诱导因子-1α的表达，同时增加肿瘤血管中化疗药物的传递，这种机制可能提高化疗药物在肿瘤组织的渗透性，进而提高肿瘤组织对化疗药物的敏感性[9]。KO等[10]发现，GTN可通过减弱AKT通路蛋白的活性以及抑制胸苷酸合成酶的合成，抑制肺癌细胞系A549和H1703的增殖。BOUAOUICHE等[11]研究发现，GTN能增强转移性去势抵抗型前列腺癌(mCRPC)对化疗药物多西他赛的耐药性，认为这可能与可溶性簇蛋白(sCLU)的表达水平升高相关，抑制mCPRC细胞系DU145-DR和PC3-D12中sCLU的表达是其主要作用机制。他们还发现，使用siRNA干扰sCLU在mCRPC中的表达后，GTN对多西他赛在mCRPC的增敏作用消除，认为GTN可能是通过调节sCLU的表达增强了多西他赛对mCRPC的化疗敏感性。

2.2 金属-亚硝基复合物类药物在肿瘤治疗中的应用及作用机制 其主要的代表性药物是硝普钠(SNP)和钌亚硝基化合物。SNP是一种有效的降压药物，主要应用于各种高血压急症的治疗[12]。QUAN等[13]发现，SNP可能是通过产生NO与O2生成ONOO-对肝癌细胞系HepG2起到细胞毒性作用，认为ONOO-在HepG2细胞中的积累可引起线粒体损伤，进一步启动Caspase途径依赖性的细胞凋亡。QUAN等[13]进一步研究又发现，SNP和ONOO-清除剂FeTPPS联合作用于肝癌细胞HepG2后，FeTPPS显著抑制了SNP对HepG2细胞的细胞毒性作用，认为SNP发挥抗肿瘤的作用是由NO参与下生成的ONOO-所介导的。YANG等[14]发现，SNP在胃癌细胞AGS、MKN45、MKN28和SGC-7901中通过细胞内刺激NO释放的方式增强了肿瘤坏死相关凋亡诱导配体(TRAIL)介导的细胞毒性，进而促进了线粒体介导的凋亡信号传递途径，包括Caspase 8和Caspase 9的活化。钌亚硝基化合物是一种可通过光诱导电子传递或者氧化还原反应从金属-亚硝基化合物中释放NO的化合物，其化学式为[trans-[RuII(NO+)(NH3)4(py-X)]3+][15]。FERNANDO等[16]通过使用多通道傅里叶变换红外显微镜(μFT-IR)观察到钌亚硝基化合物在肺癌细胞A549中释放NO的动态变化过程，随着肿瘤细胞内的含量的增多，NO快速与胞内的核酸、修饰蛋白等生物分子发生氧化还原反应，从而破坏其分子结构，进而导致肿瘤细胞发生凋亡。

2.3 呋咱氮类药物在肿瘤治疗中的应用及作用机制 呋咱氮类化合物是一类经典的NO供体，其含氮杂环与半胱氨酸和谷胱甘肽等含硫醇的化合物可发生一系列氧化还原反应释放NO，从而衍生出许多以呋咱为中心体的化合物[17,18]。根据这一特性，JIAO等[19]以呋咱为核心研制出一系列化合物，并在肿瘤细胞系HepG2、MCF-7、HCT-116、B16和K562以及正常细胞系L-02和PBMCs间进行对照研究，其中化合物15a展现出较强的抗肿瘤作用，且正常细胞对它具有良好的耐受性；进一步研究化合物15a的抗肿瘤机制发现，化合物15a的抗肿瘤作用在一定程度上与NO释放量呈正相关，随着NO释放量的增加，肿瘤细胞中Bax、Bad、HtrA2和Trail R2/DR5等凋亡相关分子的表达水平相应增高，认为15a可通过内源性和外源性途径诱导K562细胞发生凋亡。WAN等[20]基于呋咱合成了15种与雌二醇衍生物构成的新型杂合体，也在肿瘤细胞MDA-MB-231、A2780、Hela和HUVEC细胞系中进行了抗肿瘤活力的研究，结果表明大部分杂合体对肿瘤细胞的活性具有较强的抑制作用，认为这些抗肿瘤作用很可能是与NO的释放和ERK/MAPK通路受到抑制有关。

2.4 S-亚硝基硫醇类药物在肿瘤治疗中的应用及作用机制 亚硝基硫醇类化合物是一种由NO与硫醇结合生成的化合物，具有抗氧化和延长NO作用时间的作用，其以半胱甘肽-S-亚硝基硫醇的形式广泛存在于人体内环境中并参与许多重要的生理活动[21-22]。S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)是S-亚硝基硫醇类化合物的代表药物。KIM等[23]发现，在药物浓度0.5 mmol/L的情况下，SNAP作用12 h后，人神经胶质瘤细胞株CRT-MG的细胞膜形态结构发生改变，并逐渐发生细胞凋亡，且这种改变具有时间依赖性和浓度依赖性；进一步研究SNAP诱导CRT-MG发生凋亡的作用机制时发现，NO会使CRT-MG的内质网发生钙超载现象，破坏内质网的稳定性，引发的Ca2+外流导致胞质中的Ca2+浓度显著增高，从而引起Ca2+依赖性的细胞凋亡。研究SNAP对内质网相关的肌醇酶a(IRE1-a)的表达情况发现，SNAP可激活CRT-MG内IRE1-a的活性，使其与肿瘤坏死因子相关受体(TRAF2)相结合，造成JUK1/2底物水平的磷酸化，这提示NO激活内质网相关的IRE1-a/TRAF2/JUN信号通路在具有内质网依赖性的神经胶质瘤细胞凋亡中发挥重要作用。

2.5 重氮烯二酸盐类药物在肿瘤治疗中的应用及作用机制 重氮烯二酸盐是由氮原子和亲核胺(包括主胺、仲胺和多胺)结合形成的，在生理条件下每分子的重氮烯二酸盐可自发释放两个NO分子，具有半衰期较长和良好的稳定性特点[24-25]。有研究表明，重氮烯二酸盐在肿瘤细胞中能够以可控的分解速率自发地释放出NO，具有良好的抗增殖活性和选择性[26]。正是由于这些优良的特性，设计以重氮烯二酸盐为核心的抗肿瘤化合物得到了科研工作者的青睐。重氮烯二酸盐类化合物的代表药物是JS-K，其主要作用机制是在GSTs催化下，通过活化反应与肿瘤细胞内谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)相结合，从而在胞内释放出NO发挥抗肿瘤作用[27]。研究[28]表明，与在正常细胞中的含量相比，GSTs在恶性肿瘤细胞中广泛过表达，JS-K正是利用肿瘤细胞这种表达差异发挥其抗肿瘤的特异性。LIU等[29]研究发现，JS-K在浓度1.25-5 μmol/L的范围内可使卵巢癌细胞株A2780和SKOV3发生caspase途径依赖性的细胞凋亡。进一步研究JS-K的作用机制时发现，JS-K使细胞内活性氧(ROS)的浓度水平显著增高，认为JS-K可能通过ROS途径参与细胞凋亡的过程。LIU等[29]还通过透射电镜观察到，经2.5 μmol/L JS-K处理后的A2780和SKOV3有自噬小体的产生，认为JS-K在细胞自噬途径上发挥着重要作用。在动物体内实验中，JS-K可抑制肿瘤的生长，提高肿瘤对顺铂的敏感性，说明JS-K在体内和体外均发挥着抗肿瘤的活性。QIU等[30]研究JS-K对肾癌细胞株A498和ACHN以及原代心肌细胞H9C2的影响后发现，JS-K可提高肾癌细胞对多柔比星的敏感性，同时可以有效降低多柔比星对心肌细胞的损伤；在这项研究中，0-1 μmol/L的JS-K未对以上三种细胞系的增殖活性产生抑制作用，而在0-5 μmol/L范围的JS-K作用下，NO在A498和ACHN的释放量显著高于H9C9，原代心肌细胞H9C9的NO含量仍维持在低水平。深入探讨JS-K在肾癌细胞的作用机制发现，JS-K可能是通过在肿瘤细胞中释放高水平的NO引起P53的磷酸化，进而激活下游促凋亡信号通路的应答，同样低浓度下JS-K在心肌细胞H9C2中维持低水平的NO释放量，可刺激其氧化应激反应而保护H9C2的生长活性。此外，JS-K在前列腺癌[31]、胃癌[31]、膀胱癌[33]、肝癌[34]等多种恶性肿瘤细胞中均表现出很好的抑制肿瘤活性作用。虽然重氮烯二酸类NO前体药物在体外细胞实验上展现出较强的抗肿瘤作用，正常组织细胞对其耐受性也良好，但是目前缺乏广泛的体内实验对其抗肿瘤作用作为补充。总的来说，根据该类药物具有稳定性和对肿瘤特异性的特点，可以深入研究其在体内的作用，探讨其是否可能成为日后应用于临床的靶向治疗药物。

2.6 NPs在肿瘤治疗中的应用及作用机制 NO在分子属性上属于低分子气体，具有光和热的不稳定性，在内环境中又容易被红细胞中的血红蛋白快速清除[35]，这使得NO前体药物在生物体上的应用面临着严峻的挑战。NPs是一种能够在表面进行化学修饰进而调整NO释放位置和延长NO释放持续时间的新策略，可极大提高NO的稳定性，同时根据化学修饰的改变以及温度、光线、PH等环境条件的变化增强NO对肿瘤的靶向作用。此外，NPs结构表面存在亲水相容性聚合物聚乙二醇(PEG)，可避免循环系统中单核细胞和巨噬细胞的识别，减少与血红蛋白的相互作用进而延长药物作用时间[36]。WU等[37]开发了一个新型纳米粒子释放NO的合成策略，将S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)偶联到一段两性共聚物的亲脂性末端的聚乙二醇-硫化丙烯(PEG-PPS)，形成一种NO负载能力高、稳定性良好且具有GSH持续活化释放NO能力的纳米颗粒聚合体PEG-PPS-GSNO。在体外实验研究中，PEG-PPS-GSNO可通过转亚硝基反应消耗GSH，形成PEG-PPS-GSH复合物，释放GSNO，进而通过GSNO在靶细胞内释放出大量的NO，引起ROS的增加，从而发挥抗肿瘤作用。为进一步研究PEG-PPS-GSNO在克服癌症多药耐药方面的潜力，将阿霉素(DOX)包裹到PEG-PPS-GSNO纳米颗粒中，与单纯用药DOX组相比，纳米颗粒PEG-PPS-GSNO-DOX对阿霉素耐药肝癌细胞株HepG2/ADR的药物敏感性提高了3倍，同时对正常细胞的耐受性良好。NIU等[38]基于纳米粒子的合成思路，设计了一种10-羟基喜树碱(HCPT)负载的电荷反转壳聚糖纳米颗粒与苯磺酰氧化呋咱共价结合，命名为HCPT/CTS-NO-DMMA NPs，这种NPs释放NO的能力依赖微环境中GSH的浓度水平，利用GSH常常在肿瘤细胞内高表达的这种特性将其靶向作用于肿瘤细胞。在体内实验研究中发现，HCPT/CTS-NO-DMMA NPs可直接靶向作用于肿瘤细胞，且药物不良反应明显小于单纯用药组。总体来看，可释放NO的NPs相比于传统的NO前体药物作用更强，在体内实验研究中不良反应更小。另外，由于NPs的体积极小，在肿瘤微环境中的渗透上，药物也有很大的优势。

当前研究[39]结果表明，NO在肿瘤细胞中的浓度水平和持续时间是发挥其抗肿瘤活性作用的关键所在。高浓度与低浓度的NO在肿瘤细胞中发生的作用完全不同，可以说是一把“双刃剑”。高浓度的NO在肿瘤内可诱导活性氮和活性氧的显著增加，引发一系列的氧化反应和亚硝化反应，导致肿瘤内细胞器结构、功能受损以及核DNA损伤和细胞凋亡；低浓度的NO可促进肿瘤血管生成从而增强其营养的供给，促进肿瘤的生长[40]。且不同的肿瘤细胞株对NO的浓度水平效应有所差异，不同的正常组织细胞对NO浓度水平的耐受程度也存在差异。但目前在体内实验中对精准把握NO浓度方面的研究仍是空白。另外，鉴于在保持NO分子稳定性和适应人体内环境方面的优势，关于NO前体药物与各种纳米聚合物相结合方面的研究，有可能成为未来的研究趋势。

总之，有机硝酸酯类、金属-亚硝基复合物类、呋咱氮类、S-亚硝基硫醇类、重氮烯二酸盐类和NPs等NO前体药物在体外体内实验中表现出比以往单纯使用传统化疗药物的抗肿瘤作用更具有优势，它们可以通过诱导肿瘤细胞发生周期阻滞、损伤DNA、增强肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性、改善肿瘤细胞对化疗药物的耐药性等途径提高肿瘤治疗效果，但缺少更多的基础实验和临床实验的数据支撑。研究出一种安全性高、特异性强、能在临床应用中的NO前体药物，有光明的应用前景。