猪胚胎冷冻技术的研究历程与未来展望

（吉林大学动物科学学院，吉林长春 130062）

胚胎工程是一项综合性的动物繁育技术，对于畜牧业生产有着十分重要的意义。胚胎冷冻保存是胚胎工程中的重要环节，也是动物保种、基因库建立的必要手段。利用胚胎冷冻保存技术能够保存珍稀动物品种和优良生产性能家畜的遗传资源，促进克隆和转基因技术在生物医学研究方面的发展，推广胚胎移植技术在畜牧业生产中的应用。生猪生产作为我国畜牧产业重要组成部分，同时也是生物医学产业重要的实验动物来源。猪的克隆和转基因技术在体细胞克隆、异种器官移植和蛋白质生产等方面具有良好的研究前景。值得注意的是，胚胎冷冻技术也是转基因技术的重要环节。目前，在大多数哺乳动物中胚胎冷冻技术已逐渐成熟和稳定，利用玻璃化冷冻技术对各个发育阶段的胚胎进行冷冻保存均已获得成功。然而，由于猪胚胎的特殊理化性质，导致猪胚胎冷冻保存的研究进展十分缓慢。因此，建立和优化猪的胚胎冷冻体系的研究既具有重要的理论意义也具有重要的应用价值。

1 猪胚胎常规冷冻

胚胎的冷冻保存是指将胚胎和冷冻剂装入冻存管中，经过降温后使胚胎的生命活动暂时静止，并能够通过升温恢复正常生命活动的保存过程。哺乳动物胚胎冷冻技术最先使用的方法是缓慢冷冻法，Whittingham等[1]通过逐渐降温（0.3～2℃/min） 到 - 80℃后投入液氮中，将小鼠胚胎保存8 d后，取出冷冻的胚胎，通过胚胎移植后可成功繁殖后代。这一方法使哺乳动物胚胎的冷冻保存成为可能。但是由于降温控制和实验设备等要求较为苛刻，距离实际应用还有一定距离。之后，Willadsen等[2]在此基础上进行了改良并开发了快速冷冻法，将胚胎置于冷冻剂中，1℃/min -的速度缓慢降温至 40℃时投入液氮中保存。在解冻时，直接放入25℃的温水中快速解冻。这种方法由于操作过程时间较短，操作流程简便，因此得到广泛应用。这2种常规程序化冷冻方法在牛[3]、羊[4]、马[5]甚至人类[6]胚胎中成功应用并繁殖了后代。

传统的胚胎冷冻方法在猪繁殖方面一直无法成功应用。研究发现，猪胚胎具有低温敏感性，当达到一定生理温度（15℃）时，便会造成不可逆转的生理损伤。Wilmut[7]和Polge等[8]首次提出胚胎的低温耐受性与脂质含量有关。Fujino[9]和Nagashima等[10]的研究证实在猪胚胎发育过程中不同时期胚胎内脂质含量存在显著差异。胚胎在发育初期脂质含量高，耐低温能力差。直至发育至桑葚胚后，脂质含量显著下降，胚胎才能够冷冻保存，因此，发明了离心冷冻法。通过离心将细胞内脂质离心至胚胎的一侧，然后通过显微操作将聚集的脂质液滴从胚胎中去除。去脂后，显著提高了猪胚胎的低温耐受性。基于这一方法，研究人员成功将2～8细胞期的胚胎以常规缓慢冷冻法保存[11-14]。然而，研究一直未能成功通过胚胎移植获得后代，或成功率极低且试验无法重复。这一问题直到玻璃化冷冻技术的出现，才得以解决。在我国研究历史中，张德福等[15]通过开放式拉长细管（Open Pulled Straw,OPS）玻璃化冷冻法，首次获得了猪胚胎超低温（-196℃）冷冻后代。

2 猪胚胎玻璃化冷冻

玻璃化冷冻（Vitrification）方法于1985年由Rall等提出。玻璃化是指高浓度的冷冻剂在高速降温时可以由液态转变为非晶体的固态，这种状态保存了分子和离子的正常分布，不会形成冰晶结构从而保护细胞形态的完整。玻璃化冷冻是将胚胎置于高浓度的冷冻剂中，细胞外高渗透压和势能使胚胎脱水，同时细胞质内源性的大分子物质浓缩和冷冻剂中保护物质的渗入，使其降温时进行玻璃化而不形成冰晶。

1994年Dobrinsky[16]首次应用玻璃化冷冻法，使用甘油作为冷冻剂成功保存了猪的扩张期囊胚和孵化囊胚。从此，猪胚胎玻璃化冷冻技术开始迅速发展，并逐步进行改良。1997年Vajta[17]开发了OPS玻璃化冷冻法。具体方法是将0.25 mL的冷冻细管加热拉长，使其直径降低至0.88 mm，并使管壁厚度降低至0.07 mm。因为管壁较薄，温度传导性好，使胚胎迅速通过冰晶形成的危险温区以减少冷冻造成的细胞损伤。由于细管内部体积小，可有效地减少冷冻剂使用，降低冷冻剂的细胞毒性造成的细胞损伤。基于此原理，科研人员开发了超细开放式拉长细管冷冻技术（Superfine Open Pulled Straw,SOPS）和玻璃化快速冷冻仪冷冻技术（Vit-Master-SOPS）[18]。利用以上2项技术，研究人员发现，保存的扩张期囊胚存活率和孵化率不受影响，但保存的桑葚胚和初期囊胚的孵化率还是有所下降[19]。进一步的研究表明，在没有去除脂质的情况下，利用OPS技术甚至能够保存2～4细胞期的胚胎[20]。因为无需进行脱脂处理，因此胚胎保留了完整的透明带。玻璃化的桑葚胚和囊胚进行胚胎移植后，成功获得了后代仔猪[18,21-23]。同时发现，OPS玻璃化冷冻会显著降低初期胚胎的存活率[20]。综合之前的研究结果，研究人员将脂质离心技术和OPS玻璃化冷冻技术相结合，显著提升了早期和孵化囊胚期冷冻胚胎的存活率[24,25]，而且使体外生产的胚胎（In Vitro Production of Embryos,IVP）也能够得到保存。

为了满足农业生产需求和达到生物医学研究的标准，胚胎的冷冻保存需要尽量保持透明带的完整，以保证生产的稳定性和较高的生物安全性。但是在机械离心脱脂法中，使用玻璃针在透明带穿刺以去除脂质的操作，显著增加了胚胎污染的风险。同样，在玻璃化冷冻中部分操作方法需要样品直接与液氮接触来提升降温速率，这同样也增加了胚胎冷冻和存储过程中被污染的风险[26-28]。基于这些需求，胚胎保存技术开始进一步改进。Li等[29]提出了一种不需要显微操作的胚胎脱脂冷冻保存方法，即使用胰蛋白酶处理胚胎或者将胚胎处置于高渗透压溶液中，以扩大卵周间隙，之后通过离心使极化的脂质滴与卵裂球的细胞质之间的桥状结构破裂，导致脂质滴无法重新分布到胚胎的卵裂球中，而是保留在完整的透明带内，从而降低胚胎冷冻过程中脂质含量上升导致的低温敏感性。这种方法降低了操作造成的污染风险，同时也提升了工作效率，使IVP胚胎的商业生产成为可能。从另一角度出发，为了降低直接接触液氮造成的污染，Misumi等[30]开发了微风量空气冷冻法（Micro Volume Air Cooling,MVAC）。他们研发了一种特殊的设备结构，避免了胚胎冷冻剂和液氮的直接接触，有效的降低了污染风险。但由于设备结构的特殊性，离实际应用仍有一定差距。

3 猪胚胎玻璃化冷冻的研究方向

3.1 玻璃化冷冻剂的改良

冷冻剂作为冻存胚胎的直接载体，对其进行改良可有效地保护细胞结构，提升胚胎耐低温能力。冷冻剂根据其作用方式，可以分为渗透性冷冻剂和非渗透性冷冻剂。渗透性冷冻剂是指具有可以进入细胞质中特性的冷冻剂，一般为小分子物质。其中常见的有二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）、甘油（GL）等。非渗透冷冻剂则不能进入细胞，其通过改变细胞外渗透压来降低胚胎内水分含量，包括蔗糖、葡萄糖、聚乙烯醇（PVC）等。研究表明，这2类冷冻剂对猪囊胚保存的作用效果无显著性差异[31]。高剂量冷冻剂在使细胞脱水的同时也存在细胞毒性，有研究证明根据胚胎状况可以适当降低冷冻剂浓度，不会降低冷冻效果[32,33]。但关于冷冻剂浓度和处理胚胎时期的研究，仍有待探索和改良。

新型冷冻剂的研发也是十分重要。1992年Rubinsky等[34]首先发现了鱼抗冻蛋白质（AFGPs）并添加在抗冻剂中，显著提升了冷冻的猪卵母细胞的活性。抗冻蛋白质可以与哺乳动物细胞膜相互作用，阻止冰的结晶化和晶体的生长，保护细胞膜结构。抗冻蛋白的应用，提供了冷冻剂改良的新思路，一些天然的蛋白质或多肽开始被研究并应用于冷冻剂中。例如ε-聚赖氨酸（ε-PL），它是一种有抑菌活性的L-赖氨酸大分子聚合物，具有有效浓度低、安全无毒、水溶性好等优点。研究发现在冷冻液中添加30 g/L的ε-聚赖氨酸（ε-poly-lysine），平衡1 min，冷冻效果最好，囊胚期胚胎的存活率达91.2%，孵化率达89.7%。Maki Kamoshita等则通过添加ε-聚-L型-赖氨酸（ε-poly-L-lysine）成功冷冻了猪原核期胚胎。因此，关于冷冻剂成分的改良仍有很广泛的研究空间。

3.2 玻璃化冷冻流程的优化

从最开始的OPS玻璃化冷冻法，到SOPS和Vit-Master-SOPS技术的改良，玻璃化冷冻承载工具开始迅速发展。基于降低冷冻剂用量，提升温度升降速度的最小体积冷冻（Minimum Volume Cooling,MVC）[35]的概念，研究人员开发了微滴冷冻法（Microdroplet），将胚胎和冷冻剂混合制作成冷冻液滴，直接滴入液氮中进行快速冷冻，收集冷冻形成的固态颗粒进行保存[36]。DinnyésA等[37]使用的固体表面玻璃化法 （Solid Surface Vitrification,SSV），将液氮更换为预冷至-150℃的金属板，也具有同样的效果。Lane等[38]研发的Cryo-loop工具是一个顶端固定了宽20 μm、直径0.5～0.7 μm尼龙圆环的不锈钢锥。在使用时先将Cryo-loop浸泡在冷冻剂中，利用液体的表面张力形成一层薄膜，再将胚胎转移到薄膜上并直接投入液氮中保存。基于此原理，研究人员开发了极速冷冻薄膜（Cyrotop）。这种设计使胚胎的玻璃化体积达到了0.1 μL。发现使用Cryotop工具较微滴冷冻法，能够显著提升猪囊胚玻璃化冷冻的成活率[39]。

由于直接接触液氮冷冻以及较为复杂的操作过程，如上文所述，这些方法还存在着种种弊端，无法满足试验和生产的要求。在保证冷冻效果的同时，也需要简化生产操作，降低设备使用成本，以达到可以推广使用的目的。因此，玻璃化冷冻流程的优化仍需要深入研究。

3.3 玻璃化冷冻与多组学研究

随着测序技术的更新发展，生物领域的研究跨入了转录组学、蛋白质组学、代谢组学等多组学联合分析的时代[40]。多组学研究能够从分子层面上解析复杂的生物学进程，使生物发育、衰老、死亡的机制研究更为深入透彻[41]。在胚胎冷冻方面，组学的研究才刚刚开展，而关于玻璃化冷冻对猪胚胎的组学研究则尚未报道。Miriam[42]和Bartolac等[31]通过qPCR检测了玻璃化冷冻的胚胎中基因的差异表达。发现冷冻剂的添加并不会改变囊胚中胰岛素样生长因子2（Insulin-like Growth Factor 2,IGF2）和其受体（IGF2R）的基因表达。但玻璃化冷冻后会导致囊胚中的转录因子（POU Class 5 Homeobox 1,POU5F1）、热休克蛋白 （Heat Shock Protein 70,HSPA1A）、IGF2和IGF2R等的基因表达发生显著性改变。因此，使用转录组学从分子水平揭示胚胎玻璃化冷冻过程中发生的变化是可行的，进而使多组学的联合分析成为可能。解析玻璃化冷冻影响胚胎生存率的作用机制，对未来玻璃化冷冻的改良具有重要的参考意义。

4 总结与展望

经过近40年对胚胎长期冷冻保存技术的研究和探索，至今该技术已在胚胎工程、动物繁殖和生物医学等行业发挥了重要作用。虽然猪胚胎具有特殊的生物学特征，使其冷冻保存较为困难，研究进展也相对缓慢。但是，随着生物技术的不断发展，使得针对猪胚胎低温敏感和冷冻损伤的分子机制探究成为可能。同时，随着更多新型生物材料的研发和应用、胚胎冷冻保存技术的升级以及理论的不断进步，使猪胚胎冷冻保存的商业化生产成为可能。