荧光 PCR 检测非洲猪瘟病毒的注意事项

（山西省太原市动物疫病预防控制中心， 山西太原 030027）

非洲猪瘟（African Swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病。自2018年底我国发生非洲猪瘟疫情以来，给养猪业造成极大经济损失[1]。利用荧光PCR检测非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）是当前诊断最有效的手段，对基层疫情排查、养殖场安全监管、屠宰场宰前检测都有重要意义。但是，由于基层实验室人员素质参差不齐、操作经验不足、设备条件有限，为提高检测准确性，本文将检测中常见问题及注意事项逐一分析，总结如下。

1 实验室及人员条件

PCR操作室应与其他实验室分离，且按准备区、核酸提取区、核酸扩增区等划分，且人料分离，均单向移动。各区内均应安装通风设备、紫外灯等消毒设备。各区内仪器、耗材须独立使用。

操作人员应进行岗前培训，了解分子生物学基本知识，养成规范化操作的习惯，能够在实验室正确操作检测设备、防止污染、出现状况及时解决。不同区域操作应穿本区域的工作服，试验中不得在不同区域无序流动，避免无关人员出入实验室。

2 方法的选择

2.1 荧光PCR快速检测

常用于县级以下兽医实验室、屠宰厂、养殖厂等。此法免去提取核酸的步骤，具有检测时间短的优势。但为提高结果准确性，在操作中尽量用新鲜的血液或组织样品。为避免血红素对扩增结果的干扰，全血与血清所用的剂量，应严格按说明书区分取样。在离心后如遇果冻状样品无法继续实验时，可将样品减少使用剂量后（如10 μL缩至8 μL，目的是减少样品在溶液中的浓度）重新加液离心。若室温达不到20℃，可适当延长1～2 min的室温孵育时间。

2.2 荧光PCR标准检测

目前，实验室多采用此方法检测，具有准确度高、Ct值相对稳定等特点。以下几点注意事项主要针对此方法[2,3]。

3 样品采集

3.1 血液样品

3.1.1 抗凝血

用含有EDTA-K2（紫盖）的采血管从猪的颈静脉、前腔静脉或耳静脉抽取全血。EDTA在全血溶液中若浓度过大，会对扩增结果造成干扰，导致假阴性出现，采血时溶液尽量达到采血器刻度线，若量不足，样品前处理时加生理盐水补齐到刻度线即可。避免使用含肝素（绿盖）的抗凝管，肝素会抑制PCR反应，造成假阴性。如自配 EDTA 溶液，为减少其浓度过高对扩增结果的影响，应控制 EDTA 溶液体积占采血管溶液总量的 10%以内。刚死亡的生猪可以采集心脏血，但注意防止污染环境。采血后，采血管上下匀速翻转 2 次，防止局部抗凝血不良。不建议剪耳收集血液，溢出的血液易造成环境污染。全血 4℃保存送检，全血不宜直接低温保存，可离心取上层血清冻存[2-4]。

3.1.2 血清

使用不含抗凝剂的采血管 （红盖） 采血，方法同3.3.1。采样后建议就地倾斜静置一段时间，防止采样后直接运送，车程颠簸造成溶血。返回实验室室温倾斜放置，析出血清后，收集血清 （1 mL），可用试验或冷冻长期保存。

3.2 其他体液样品

由于唾液中病毒含量受采样时饮食影响较大，且受唾液内核酸酶影响[5]，使非洲猪瘟病毒核酸的降解较快，因此除疫病发生的早期检测需要，其他情况不建议采集唾液。鼻拭子采样，用棉棒采集鼻中隔后深处分泌物，然后将棉棒置于含有 100 μg/mL 青霉素和链霉素的PBS （保证棉棒浸润后管内仍有大约 250 μL 液体即可）EP 管中，冷藏运输。若采集精液，也应冷藏运输，待固化又液化后使用。

3.3 组织样品

首选脾脏、淋巴结，其次是扁桃体、肾脏、心脏、肝脏和肺，剪取病变部位明显拇指盖大小即可。对于死亡时间较长的动物可采集骨髓。组织样品采取冷藏运输，实验室可冷冻保存。

3.4 环境样品

主要采集养殖场、屠宰场等可能污染的环境样品，采集以易污染环境的“边、角、缝”为主。养殖场员工鞋底、衣物、头发、鼻孔也可采集。多点取样，每点大于5 cm2。用湿润的无菌脱脂棉球涂擦，更易吸附病毒，浸润于10倍体积的生理盐水中送检，样品的保存同体液样品一致。

3.5 猪肉制品等其他样品[3]

3.5.1 猪肉制品

猪肉：打孔器多点取样，外部表层可用刀片刮取；饺子：剪开面皮取红肉部分；午餐肉、肉脯：采集多块，每块分不同位置多点取样；火腿：前中后及肠衣都要截取；腊肉：取瘦肉即可。以上样品均取黄豆粒大小即可。

3.5.2 饲料

原料玉米、鱼粉均可采集，成品饲料采集同一批次不同部分混合放于一个自封袋即可。

4 试验操作

4.1 样品前处理

4.1.1 液体样品

取抗凝血、血清、唾液、鼻拭子液体、精液等猪体液及环境样品的液体0.5 mL，高速冷冻离心机12 000 r/min离心3 min，或普通离心机2 000-3 000 r/min离心5 min均可，取上清液200 μL，用于核酸提取。

4.1.2 固体样品

取0.2 g左右的猪肉（及制品）或饲料（及原料），加入10倍体积生理盐水（约1～2 mL）中匀浆，取0.5 mL匀浆液按4.1.1方式和剂量离心、取上清液用于核酸提取。饲料等稠度大的可适量增加生理盐水的量。

4.1.3 注意事项

①匀浆和离心的必要性。很多试验操作为节省步骤，前处理时不离心，直接取样本原液用于试验，这样易造成溶解不充分，各部位病毒不均匀，且原液含有的杂质或血红素等非特异性的干扰，极易造成试验结果不准确或产生假阴性。

②混样量。早期非洲猪瘟患病猪症状明显，病毒载量多，采样检测Ct值较小，混养数量可较多；随着临床症状不明显的样品增多，样品Ct检测值逐渐增大。当混样数量太多，混样后的Ct值大于35时极易造成假阴性。为提高检测准确性，当本地单个样品Ct值大于或等于35时，建议混样量不超过10个。若按本地经验数量混合后检测，Ct值均未超过35，可延续混样经验值。

4.2 核酸的提取

4.2.1 不同提取法

目前提取核酸的主要方法有柱式法和磁珠法，各有优劣。柱式法人为操作影响因素大，对实验人员经验要求高。磁珠法，人为干扰因素较小，但仪器成本高，采用此方法试剂盒需在使用前提前半小时取出回温。

4.2.2 注意事项

控制样品及核酸污染。①试验加样要尽量选能满足需要且较大容量的枪，防止加样过程中枪头液体过满产生倒流而污染移液器；②提前取出EP管，置于加样架上，严禁操作过程中手直接伸进EP管袋中取管，如有需要，用镊子夹取；③样品量过满的采样管尽量两手开盖，小心液体污染拇指，造成上下样品间污染；④同一样品灭活后检测Ct值会增大，属正常现象；⑤核酸提取后，所有耗材及液体均要置于含消毒液的自封袋中，封口包装，避免直接接触空气，造成实验室核酸的气溶胶污染；⑥核酸提取后室温易降解，最好直接用于扩增检测或- 20℃保存。

4.3 PCR反应体系的配制

①提前30 min将试剂盒置于室温，待各反应管中液体充分回温融化后再操作；②选择合适剂量的移液器，精准取样，防止枪尖液体挂壁太多导致试剂不够用；③加样加到PCR反应管底部，防止气泡产生影响扩增结果；④阳性对照管必须进行瞬时离心再开管，加样时尽量使用带滤芯的10 μL长枪头，防止污染，所有样品加完后最后加阳性对照；⑤明确所用PCR仪采光方向，防止人为的标记记号影响采光，导致结果差异；⑥扩增后待反应管凉透再取，切记不要打开反应管，防止气溶胶污染，按生物安全相关要求处理即可。

4.4 结果常见问题分析

扩增是在阴阳性样品成立的条件下，样品在指定范围内出现特异性的扩增曲线为标准，但试验受环境、样品、机器和操作等多种因素影响，常见问题有以下4种。

4.4.1 假阳性

①出现假阳性的主要原因是污染，实验室分区和人员流向不合理，未按规定走向顺序移动，人为引发核酸污染；②实验室长期使用，生物安全措施执行不规范，造成实验室核酸气溶胶污染；③体系配制过程中阳性对照未离心就使用或开管、盖口朝下放置等人为操作问题，造成阳性对照污染样品及环境。④试验操作不当，样品中阳性扩散污染其他样品。

4.4.2 假阴性

①样品未加入反应体系中。由于加样量少，加样时应确保样品枪头深入体系液中，全部注入；②样品含抑制剂（如EDTA、血红素等）干扰荧光信号，应尽量降低此类物质在样品中的含量；③Ct值大于35的检测样品受环境、操作等人为因素影响较大，且随着保存时间延长可能导致复检结果阴性；④人工标记的记号阻碍荧光信号采集方向；⑤不同厂家阳性样品交叉使用，造成阳性扩增失败；⑥样品的储存、前处理、提取方法的不合理及不同人员的操作均可能导致假阴性。

4.4.3 复检结果不一致

①同一样品的Ct值灭活后检测较灭活前大；②试剂多次冻融后复检测；③唾液样品受酶干扰大，降解快，Ct值变化快；④全血冷冻保存后再次检测；⑤血液样品受血红素干扰大，溶血样品前后检测的溶液中血红素含量差异大；⑥混样量太多，样品浓度太低，导致每次取样误差大。

4.4.4 其他

①整体或部分翘尾现象，大多由于实验室形成核酸气溶胶污染。②样品和阳性对照都无曲线时，应重新核查扩增时程序的设置、试剂购进后的保存及使用过程中反复冻融等人为因素；③阳性对照成立但样品无扩增曲线，应考虑样品及耗材的问题，如在提取核酸时避免用含 EDTA 的管洗脱等错误操作。

5 PCR实验室的生物安全

5.1 消毒

试验前应对生物安全柜开紫外灯照射30 min，试验台废液缸内套袋，内倒消毒剂，试验过程中用过的吸头等废弃物品弃入废液缸，且浸泡于消毒液中，试验过程中有污染随时用消毒剂擦拭；试验操作结束，及时用普通消毒剂和核酸祛除剂擦拭操作区域及使用过的移液器等物品。每次试验结束后地面、桌面及使用过的仪器均应用含有消毒剂的水整体清洁；试验服每周消毒、清洗，且不同区域不得交叉使用。

5.2 控制核酸污染

5.2.1 核酸污染的危害

在核酸（DNA或RNA）的提取和扩增中，如不规范操作，核酸可存在于桌面、仪器、耗材以及空气中，尤其是气溶胶携带的核酸片段在空气中漂浮，很难消除，也是造成试验假阳性的重要原因之一。

5.2.2 避免污染产生的方法

为了避免污染，除做好常规消毒外，建议使用专门祛除核酸的清洁剂，置于不同操作间及生物安全柜中，尤其是核酸提取、体系配制和扩增区域。每次操作结束及时喷涂擦拭。在操作完后应继续让生物安全柜通风至少10 min，过滤操作过程中产生的气溶胶性污染，通风结束再开紫外灯消毒。严禁将含有核酸的耗材用高压锅消毒，高压锅放气时会直接污染实验室。核酸提取使用过的耗材和PCR管，直接放入含消毒剂的自封袋内密封处理。室内环境要时常开窗通风，保证实验室空气的流通。

5.3 耗材及废弃物的处理

使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理后密封。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后再移出，按医疗废弃物途径销毁。