指纹图谱技术在黄精质量控制研究中的应用分析

罗 莎 ，鲍康德 ，姜程曦

（1.温州大学生命科学研究院，浙江温州 325035；2.浙江省生物医药协同创新中心，浙江温州 325035；3.池州市九华山黄精研究所，安徽池州 242811）

中药的质量鉴定和质量评价控制方法有很多，指纹图谱属于其中之一[1]。通过处理之后的药材，再经过一定的分析技术和仪器进行检测，可以反映该药材及制剂中各类不同特性的共有峰图谱的方法，称为中药指纹图谱[2]。中药指纹图谱与指纹识别不同，指纹识别是由基因决定的，基于先天遗传;而中药指纹图谱则是基于该植物物种后天的代谢产物。指纹识别强调的是“特性”，而中药指纹图谱既包含“共性”又包含“特性”。“共性”是能反映不同药材之间共有的特征;“特性”是能反映该药材与其他物质的区别，还能反映不同地区或不同采收时间的同种药材的差异[3]。因此中药指纹图谱既能用来鉴别不同种类的药材，又能评价同种类药材质量的好坏。

黄精是中国传统的中药材[4]，为百合科黄精属植物的干燥根茎，分为滇黄精（Polygonatumkingianum Collet Hemsl）、黄精（Polygonatumsibiricum Red）和多花黄精（Polygonatumcyrtonema Hua）。黄精具有养阴润肺、健脾益气、润肺止咳、滋肾、内热消渴等功效[5]。黄精分布较广，滇黄精在云南、四川、贵州、广西等省都有分布；黄精在东北地区、西北地区、华北地区、华东地区等有分布[6]；多花黄精在华东地区、中南地区、四川、贵州等地有分布[7]。由于不同产地黄精的质量和成分含量各异，因此，需要通过建立指纹图谱为黄精的质量控制研究提供理论依据。

1 指纹图谱技术的应用现状与优势

指纹图谱技术作为一种综合的、可量化的鉴别分析手段，具有模糊性、整体性和专属性，适用于控制中药在生产过程中各环节中间体及成品的质量，对药材、饮片、提取液、浓缩液、浸膏粉、配方颗粒进行一致性评价[8-9]。目前，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描（TLCS）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）等色谱法，以及紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）、质谱法（MS）、核磁共振法（NMR）和X-射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS 和GC 已成为公认的3 种常规分析手段[10]。由于HPLC 具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点，中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且已积累较丰富的应用经验。因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。随着HPLC-MS 和GC-MS 等联用技术的应用，中药指纹图谱技术更趋完善。

中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应、能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都很难解决这一问题。建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价[11-12]，这也正好符合中医药整体学说。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。总之，中药指纹图谱的研究和建立，对于中药质量控制、促进中药现代化具有重要意义。

2 HPLC 法在黄精指纹图谱研究中的应用

高效液相色谱法（HPLC）是一种较为常用的药物组分分离分析的手段，是选用高压力泵将流动相泵进到加了填充剂的色谱柱中，进而对样品进行分离、测定的一种色谱方法[13-14]，具有操作简单、分析迅速、高效率分离等优点[15]。当前HPLC 已经普遍应用于蓝眼类、黄酮类[16]、皂苷类[17]、香豆素类[18]、生物碱类[19]等化学成分的分析[20]。王海洋等[21]为了建立黄精多糖组成糖的指纹图谱，采用柱前衍生化HPLC 法测定黄精多糖的组成，并建立其组成糖的指纹图谱。结果显示，黄精多糖有4 个共有峰，分别为甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖。董治程等[22]以薯颈皂苷元为对照品，对黄精药材进行HPLC 指纹图谱研究，为其药材质量控制提供了新的方法，同时为提高中国药典中黄精质量标准奠定了一定的基础。程林等[23]应用RP-HPLC 建立黄精药材酸水解物的指纹图谱，并且经过参考文献[24-25]及多次试验发现，黄精药材经过酸水解衍生化后通过高效液相分析，色谱峰较高、较多且分离度良好，所以可以认为黄精药材的酸水解物适合建立指纹图谱，能够为其药材的质量评价提供参考。根据程林等人的研究，除了选择薯蓣皂苷或糖类为指标对黄精进行质量检测外，还可选择黄精药材的酸水解物作为指纹图谱建立的指标成分。赵欣等[26]用高效液相色谱-紫外检测器联用建立陕西杨凌黄精的指纹图谱，结果表明，用高效液相色谱-紫外检测器联用建立的黄精指纹图谱稳定性、重复性较好。但是由于试验样品及采集范围较小，且采收时间在3、10、11 月份不等，是否为其他各产地的黄精质量控制提供精准参考还有待考证。可在赵欣等人研究的基础上增加样品基数，或根据不同采收时间建立不同的指纹图谱，然后再进行对照比较，为黄精的质量标准提供更加精确的参考数据。

3 UPLC 法在黄精指纹图谱研究中的应用

超高效液相色谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）是一种新式液相色谱技术，是由超高压力系和小颗粒填料色谱柱结合而成，其联合之后能够很明显地改进检测样品的灵敏度和色谱峰的分离度，可以缩短样品分析时间，还可以减少溶剂消耗[27]。其在原理上与HPLC 类似，但又比HPLC 多了很多优点。UPLC 的色谱柱粒径最小达到了1.7 μm，而HPLC 的色谱柱粒径一般是5 μm，因此UPLC 使得物质的色谱峰变得更窄，增加了峰容量，大大提高了检测的灵敏度[27]。周宝珍等[3]采用超高效液相色谱法，建立黄精UPLC 指纹图谱。通过UPLC 对5 个不同来源的黄精成分含量进行研究，发现不同品种的黄精成分含量不一样，由于温度、光照、地理环境等因素的影响，同一品种不同产地的黄精成分含量也有差异。同时也发现每个产地的4、7、10 号共有峰的峰面积都很大，因此猜测4、7、10 号峰所对应的成分应该是黄精中比较重要的有效成分，若进一步确认这些成分，对黄精的深入研究非常重要。

目前黄精UPLC 指纹图谱的研究报道屈指可数，这对于今后的研究来说既是困难也是机遇。基于周宝珍等人的研究，可选择适宜的试验方案继续进行，对黄精的研究可能会有较大的突破。另外，该研究仅对黄精的UPLC指纹图谱进行了初步探索，并未对黄精多糖、黄酮类、皂苷等进行分析处理，因此，可在此基础上选择合适的样品用UPLC 对其进行研究测定，或对其有效成分峰进一步研究分析，为黄精的质量控制研究提供可靠的理论依据。

4 分子标记法在黄精指纹图谱研究中的应用

目前，随着分子标记技术的发展，SSR（Simple Sequence Repeat）分子标记以其较高的稳定性、重复性和多态性的优点，已经应用于多种药用植物的研究，包括刺蒺藜、肉果草、菊花、桑黄及鸡血藤等。但在药用黄精上的相关研究尚属空白，急需筛选黄精的SSR 核心引物并构建核酸指纹图谱[28]。

王世强等[29]对在全国32 个不同地区的野生药用黄精种质收集整理基础上，通过前期转录组测序分析，筛选出黄精多糖代谢合成通路的关键酶基因后，据此开发并筛选SSR 核心引物，并构建黄精品种（系）DNA 指纹图谱库，为今后黄精的品种选育及鉴定提供技术支撑。该研究成功应用12 对基于多糖代谢合成通路的关键酶基因开发的SSR 引物，一次性鉴定32 个地区（3 个种）的黄精材料，对多糖含量接近且亲缘关系相近的黄精品种也能扩增出多态性条带并进行区分，且每个地区的指纹图谱具有唯一性。杨培等[30]对44 份黄精属样品应用通用引物扩增其叶绿体 rbcL、matK、psbA-trnH 及核 ITS2 和 ITS 序列，分析其种内、种间变异，应用BLAST 和Nearest Distance方法计算物种鉴定效率。结果显示，DNA 条形码候选序列psbA-trnH、matK 及rbcL 不适用于黄精属药用植物的鉴定，叶绿体全序列或通过叶绿体全序列筛选合适的DNA片段可能是该属药用植物分子鉴定的方向。

王世强等人[29]的研究除了构建传统的指纹图谱代码，还为每一个地区的黄精种质构建指纹图谱二维码，可以高效、方便地录入大量信息，有助于黄精优良种质及品种的鉴定。该DNA 指纹图谱库的构建，一方面可以服务于黄精种质资源遗传多样性分析，另一方面，也可结合形态学数据库，更加立体地为品种保护、优良品种选育、优良种质鉴定等相关工作提供支持。但是，黄精属植物分布广泛，在中国境内就有30 多种，该研究将试验样本分为3个种进行研究，可参考其试验方法，对黄精其他种类的药材进行试验探究。杨培等人的研究为黄精的DNA 指纹图谱打开了思路，既然用通用引物得不到试验结果，是否可大胆尝试黄精的DNA 全序列进行试验，或基于叶绿体全基因组筛选合适的DNA 片段来进行鉴定，这都是急需解决的问题。

5 NMR 法在黄精指纹图谱研究中的应用

方圆等[31]将分离所得多糖单体通过单糖组成分析、核磁共振13C-NMR 和135DEPT-NMR 谱分析，得知多糖I、多糖II 及多糖III 的结构特点，发现多糖III 为部分被乙酯化的果胶，这种果胶类化合物在黄精中尚属首次发现。并且发现了低聚糖II 中有一个对称结构，属于肌醇类，但具体结构特点并没有进一步研究。由此可见，核磁共振氢谱（1H-NMR）是用于鉴定有机化合物结构的重要方法之一，可以获取各种有机化合物及无机化合物的包括质子的化学位移、数量、偶合关系等在内的多个结构信息[32]。另外，通过查阅文献[32-33]可知，HPLC-NMR 联用技术是同时进行未知混合物分离和结构鉴定最好的手段之一。随着HPLC-NMR 技术的进一步发展，HPLC-NMR 联用系统将成为中药质量控制最有效的手段之一[33]。那是否可利用核磁共振技术对黄精的某种糖类或其他含有质子的物质进行检测，从而建立黄精的核磁共振指纹图谱研究，以及利用HPLC-NMR 联用技术对黄精的成分进行进一步的开发研究，都需进行更加深入的研究分析。

6 其他分析方法在黄精指纹图谱研究中的应用

随着分子生物学的快速发展及应用，为中药的质量控制提供了新的思路。利用现代分子生物学的原理和方法，将动植物类中药的质量控制技术从形态、组织、细胞推进到分子水平，解决目前中药品种分类和鉴定及内在质量评价的难题。

卢燕等[34]对黄精、玉竹进行蛋白质、POD 同工酶和EST 同工酶电泳指纹图谱的分析比较，结果表明，两者的蛋白质、POD 和EST 同工酶3 种电泳指纹图谱均具有明显差异，表明电泳指纹图谱在中药品种鉴定上的可靠性、准确性。

另外，还有一些方法没有用于建立黄精指纹图谱，但在建立其他中药指纹图谱上应用相对较多。比如，邵艳华等[35]采用高效薄层色谱法建立了由9 个特征斑点构成的砂仁挥发油类成分的高效薄层色谱指纹图谱共有模式。杨波等[36]采用傅里叶变换红外光谱分析方法，采集党参药材及水提物的红外光谱并进行双指标序列分析，结果发现，所得到的党参及其提取物的红外光谱分析结果具有独特而稳定的特征，可以作为其质量控制的根据。闫新豪等[37]采用高纯水为溶剂回流提取待测冬虫夏草的有效成分，对不同产地的冬虫夏草进行指纹图谱采集。黄欣佩等[38]模拟沉香熏烧的使用过程并且应用静态顶空进样-气相色谱-质谱联用技术构建指纹图谱。冯继承等[39]建立双黄连颗粒指纹图谱，为该产品质量控制提供有效方法。以上研究均证明指纹图谱能够解释和评价中药中包含的药效成分信息，能够更加全面准确对其进行质量评价。因此，希望尽快建立更加切实有效的黄精指纹图谱，使其分析方法多元化，进一步为其质量控制体系服务。

7 结论与展望

中药指纹图谱技术在现代及未来的中药质量控制中都占有很重要的地位，其可分析中药中有效成分和无效成分的种类和含量分布的信息，符合中医、中药整体性和模糊性的特点。随着越来越多的技术不断被应用于中药指纹图谱的研究，中药指纹图谱必然在中药质量控制、中药药效成分研究、中药作用机制研究等多方面发挥更加重要的作用[40]。中药指纹图谱可鉴别出化学成分及组成层面上的差异，因此能鉴定其质量的好坏，对于中药的发展起着至关重要的作用。而保证中药质量的好坏和产业过程的全程控制，刘昌孝院士[41]提出了建设基于中药质量标志物的中药产品质量追溯系统。中药质量标志物是存在于中药材和中药产品（饮片、中药煎剂、中药提取物、中成药制剂等）中固有的或加工制备过程中形成的、与中药的功能属性密切相关的化学物质，作为反映中药安全性和有效性的标志性物质进行质量控制[42-44]。因此，将两者有效结合是保证中药质量控制的关键。

黄精作为药食同源的中药材，具有极大的开发潜质和市场价值，黄精质量的标准化、规范化是其走向大众、走出国门的基础。姜程曦等[4]通过文献分析，对黄精质量标志物进行预测，认为黄精中的多糖和皂苷类成分与其有效性密切相关，是其可能的主要药效物质基础，可作为质量标志物进行选择。可根据此推测，采用HPLC、TLCS、NMR、HPLC-NMR 联用等分析手段获取其化学组分信息并建立指纹图谱，再将试验结果进行分析整合，找到发挥作用的关键药效物质，进而发现其质量标志物，这将是今后研究的重点与难点。黄精快速发展的瓶颈在于质量的规范统一，如何快速、准确、便捷地评价黄精的质量，己成为当前亟需解决的一个难题。因此，应牢牢把握指纹图谱这一重要手段，为黄精的质量控制保驾护航，助力黄精的研究与发展。