LC-MS/MS测定比格犬血浆中的醉茄素A及其生物利用度研究

戴天明，王敏

1.广州市红十字会医院/暨南大学医学院附属广州红十字会医院/广州市创伤外科研究所，广东 广州 510220；2.广州市红十字会医院/暨南大学医学院附属广州红十字会医院骨科，广东 广州 510220

南非醉茄是一种被民间广泛利用的传统草药，它具有多种药理活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎和免疫调节等作用[1-3]。醉茄素A(Withaferin A,WA)是南非醉茄提取物中的主要活性成分[2]。近年来，有报道称WA在胶质瘤小鼠模型中具有很强的抗肿瘤活性，而且WA对肥胖小鼠有强大的抗肥胖和抗糖尿病作用，因此备受关注[4,5]。虽然南非醉茄提取物的口服保健产品已上市多年，但其主要成分WA的口服生物利用度仍未知，现有报道仅停留在使用小鼠对WA进行初步药代动力学研究[3]。为了探索WA的口服生物利用度，本研究利用LC-MS/MS检测技术，采用药物吸收行为与人体更为接近的比格犬，进行WA静脉注射和口服灌胃的药代动力学实验，评估WA口服给药的可行性，为药物临床前研发和临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与动物醉茄素A对照品(批号17136605，纯度＞99.0%)和泽泻醇C-23-醋酸酯对照品(内标物，批号16425087，纯度＞99.0%)购自成都普菲德生物技术有限公司。色谱纯的甲醇和乙腈购自美国Spectrum公司。其他试剂为市售分析纯。超纯水由Milli Q超纯水系统制备。

比格犬共3只，雄性，体重6.3～7.1kg，健康状况良好，购自北京玛斯生物技术有限公司(实验动物生产许可证号：SCXK(京)2011-0003)。比格犬在给药前12h开始禁食，直至给药后4h恢复喂食。全程饮水自由。

1.2 仪器分析方法在日本Shiseido Nanospace 1312高效液相色谱系统和美国AB Sciex 4000 Q Trap™质谱仪上建立高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析方法。数据采集与定量软件为Analyst 1.6。

WA分析的液相条件：采用Venusil MP C18(50×2.1 mm·5μm)色谱柱，流速为0.25mL/min，在室温下分析WA。流动相A为水相(乙腈:水=5:95，V/V)，流动相B为有机相(乙腈:水=95:5，V/V)。水相和有机相中均含有10mM乙酸铵。液相系统采用梯度洗脱，有机相的起始比例为30%(V/V)，0.3min时有机相开始线性上升，0.5min时升至100%。之后保持100%至2.4min，然后开始线性下降。2.8分钟时有机相比例回到30%，保持至4min结束洗脱流程。WA和内标物在此梯度下保留时间分别是1.9min和2.2min。

WA分析的质谱条件：正离子模式下，离子源温度550°C，离子喷雾电压5500V，气帘气15psi，雾化气70psi，辅助气60psi，碰撞气中等，入口电压9V，驻留时间120ms。WA和内标物在多反应监控MRM模式中，定量离子对分别为471.4～281.2m/z和529.6～451.5m/z，去簇电压分别为100V和130V，碰撞能量分别为25eV和29eV。

1.3 标准曲线与质控样品制备精密称取WA对照品两份，甲醇溶解，两份对照品分别制备WA的标准曲线储备液和质控储备液，浓度为1mg/mL。内标物泽泻醇C-23-醋酸酯对照品用甲醇溶解配制储备液。WA的工作液浓度范围为1～10000ng/mL，通过从储备液连续稀释后获得。WA的标准曲线和质控样品，采用空白比格犬血浆和工作液混合制备，标准曲线最终浓度为0.2、0.4、1、5、20、100、500、1600和2000ng/mL。质控样品最终浓度0.4、20和1600ng/mL。所有的储备液、工作液、含血浆标准曲线和质控样品配制后马上储存在4°C冰箱中待用。

1.4 血浆样品处理在100μL血浆样品中，加入20μL纯甲醇和50μL内标物(1μg/mL)，在冰水浴中涡旋混合。然后加入1.5mL乙酸乙酯，继续在冰水浴中振荡萃取15min。在4°C和14000g离心力下离心5min，取出上层溶液在真空下挥干。使用200μL流动相复溶，注入20μL上清到LC-MS/MS系统中分析。

1.5 药代动力学实验WA的药代动力学实验分为两周期给药，在3只雄性比格犬进行。第一周期进行WA剂量为1mg/kg静脉注射给药实验，第二周期进行WA剂量为2mg/kg口服灌胃给药实验，清洗期为7d。WA给药溶液浓度为1.7mg/mL，使用乙醇-solutol HS 15-纯水(10:5:85;V:V:V)的溶剂配制。静脉给药实验采血时间点为：0、0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48h；口服给药采血时间点为：0、0.05、0.13、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48h。给药前和给药后从比格犬前肢静脉采集血液约500μL，注入肝素钠抗凝的离心管中，在4°C、3000g离心力离心5min，收集上层血浆，-80℃冰箱保存待用。

1.6 药代动力学参数计算检测得到的血药浓度-时间数据，采用DAS(Direct-Attached Storage,DAS)3.0软件的统计矩模型计算药代动力学参数，包括药时曲线下面积AUC(Area Under Curve,AUC)、半衰期t1/2、平均驻留时间MRT、清除率Cl、表观分布容积Vd等[6]。

2 结果

2.1 最低定量限与线性范围通过优化液相条件，调整流动相成分(乙酸铵和甲酸含量)，以及优化药物萃取条件(乙酸乙酯、叔丁基甲醚、乙醚对比)，WA的最低定量限为0.2ng/mL，信噪比＞5。通过线性回归拟合的标准曲线线性范围为0.2～2000ng/mL，回归方程y=0.0016x+0.005，相关系数r2＞0.999，表明此浓度范围内线性关系良好。

2.2 WA在比格犬的药代动力学参数对LC-MS/MS分析方法测得的药物浓度数据，在DAS 3.0软件进行处理，获得的药代动力学参数如下：比格犬静脉注射1mg/kg的WA后，峰浓度为(1392±120)ng/mL，暴露水平AUC0～t为(925±136)ng/(mL·h)，半衰期t1/2为(14.3±2.4)h，平均驻留时间MRT0-t为(5.8±1.6)h，清除率Cl为(1.1±0.3)L(h·kg)，表观分布容积Vd为(22.7±4.5)L/kg。比格犬口服灌胃2mg/kg的WA后，达峰时间为0.13h，峰浓度为(179±32)ng/mL，暴露水平AUC0～t为(780±197)ng/(mL·h)，半衰期t1/2为(18±4.6)h，平均驻留时间MRT0～t为(12.6±3.5)h，清除率Cl为(2.6±0.7)L/(h·kg)，表观分布容积Vd为(67.5±8.9)L/kg。绝对口服生物利用度计算公式为F=[(AUC口服/AUC静注)×(Dose静注/Dose口服)]×100%，因此，WA在比格犬的口服生物利用度为(42.2±6.4)%。

3 讨论

本研究建立的LC-MS/MS方法可成功地应用于WA在比格犬的药代动力学研究。经过优化，此方法灵敏度更高，定量下限比报道的更低，有利于更准确分析样品在体内的消除半衰期[3]。实验结果表明，WA在比格犬的口服生物利用度较高，吸收较快(给药后8min达到峰值)。与啮齿类动物对比，利用已报道的不同实验室的WA在小鼠的药代动力学数据，估算小鼠口服生物利用度约为9%，远低于WA在大型动物比格犬的生物利用度42%，提示WA在大型动物中可能具有更理想的吸收程度[3,7]。此外，WA在比格犬中半衰期较长，有利于药物长时间在体内发挥药效。同时表观分布容积较大，说明药物可能较多分布在器官组织中。

综上所述，WA总体上具有良好的药代动力学性质，可作为口服候选药物，进行药物分布、代谢、排泄、安全性等更全面的成药性评估和临床前开发，为将来的临床试验或最终临床应用提供参考依据。