芦丁减轻全氟辛酸暴露致小鼠心肌损伤的作用研究

程静静，余丽丽，周勇兵，汤雨婷，马雨妍，吴俊英，刘 辉

全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，PFOA)属于全氟类化合物，是全氟烷酸的重要代表物，其不仅具有较强的稳定性，还能耐光解、水解及微生物降解，基于此类特性PFOA被大量应用于食品包装、水源、纺织中，从而造成了广泛的环境污染，并为进入机体提供了条件；而饮食是摄入PFOA的主要途径，PFOA在机体中难被代谢排出[1-2]。研究[3-4]报道，在动物组织与人体血清中均能检测到PFOA，PFOA暴露会造成肝脏、心脏、肾脏、免疫、生殖及甲状腺等大量脏器系统侵损，是具有全身多脏器毒性作用的化合物。在心血管方面，PFOA可降低成年豚鼠心室肌细胞动作电位持续时间与峰值，此外可使膜电位改变异常，促进Ca2+内流加快细胞中Ca2+负荷从而发生心肌细胞损伤[5-6]。还有研究[6-7]发现，PFOA暴露在心脏中造成的心肌细胞损伤与氧化应激密切相关，PFOA暴露易增加活性氧释放，促进细胞DNA氧化加重心肌损伤程度。因此，目前应确定安全、有效药物用于预防PFOA引起的心肌损伤，显得尤为重要。

芦丁是一种生物活性丰富的黄酮类化合物，具有预防心肌缺血、心律失常，调节血清胆固醇等作用。研究[8-9]发现芦丁可缓解5-羟色胺所致的血管损伤并保护血管内皮细胞，同时还有抗炎症、抗化学性肝损伤的作用，但芦丁对PFOA造成的小鼠心肌损伤保护作用尚不明确。本研究探讨芦丁对PFOA诱导的小鼠心肌损伤的保护机制，为开发预防PFOA毒性作用心肌损伤的药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 芦丁(纯度≥98%，153-18-4，北京百灵威科技有限公司)；PFOA(纯度≥98%，335-67-1，Sigma-Aldrich)；乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(微孔法)(A020-2，南京建成生物工程研究所)；总胆固醇(TC)测定试剂盒(单试剂GPO-PAP法)(A111-1-1，南京建成生物工程研究所)；三酰甘油(TG)测定试剂盒(单试剂GPO-PAP法)(A110-1-1，南京建成生物工程研究所)；还原型谷胱甘肽检测试剂盒(微板法)(A006-2，南京建成生物工程研究所)；总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒(羟胺法)(A001-1，南京建成生物工程研究所)。酶标仪(Synergy2，美国伯腾仪器有限公司)。

1.2 实验动物 健康SPF级雄性ICR小鼠24只，体质量18～20 g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物合格证号：SCXK(沪)2013-0006。饲养于小鼠动物房适应性1周，经蚌埠医学院动物伦理委员会批准，饲养温度(21±2)℃，相对湿度为50%～70%，光周期为每天12 h光照、12 h黑暗，小鼠自由取食，自由饮去离子水。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与心肌损伤造模 适应性1周后将24只ICR小鼠随机分为3组，每组8只，即对照组、PFOA组、PFOA+芦丁组。

对照组：在实验14 d内每日灌胃等体积0.9%氯化钠溶液，连续14 d；PFOA组：在实验14 d内每天早上9点称重后，按体质量进行5 mg·kg-1·d-1PFOA灌胃，PFOA暴露浓度设计参考WANG等[9]研究，连续14 d；PFOA+芦丁组：在实验14 d内每天早上9点称重5 mg/kg PFOA进行灌胃，每天下午3点160 mg·kg-1·d-1芦丁灌胃前搅拌水浴加热37 ℃后灌胃，芦丁浓度设计参考储金秀等[10]研究，连续14 d。期间每天记录小鼠体质量与生命体征，称量体质量与灌胃时间为固定在每天的相同时间点，每日1次，连续14 d。

1.3.2 标本制备 在14 d时，眼眶后静脉丛采集血液1 mL，并处死小鼠，血液经3 000 r/min、4 ℃离心15 min制备血清，并存放于-80 ℃待测。立即迅速取出心脏组织，去除右心耳心房及大血管，用等体积0.9%氯化钠溶液清洗，滤纸充分将水分吸干后称重，然后取一部分存放于-80 ℃环境中备用；取一部分心肌组织固定于甲醛溶液中。随机挑选5只小鼠进行生化及酶活检测，余下3只小鼠进行HE切片染色。

1.3.3 血清LDH活性检测 采用微板法测定小鼠血清LDH活性。

1.3.4 心肌TG、TC含量检测 取待测心脏组织5 cm3，采用高速组织研磨仪(Servicebio，KZ-Ⅱ)将组织和0.9%氯化钠溶液混合制作成10%心肌组织匀浆，各取0.5 mL 10%匀浆加0.9%氯化钠溶液4.5 mL制备1%匀浆，采用FD酶法测定TG、TC含量，按照测试盒说明书严格操作，采用酶标仪读取光密度值。

1.3.5 氧化应激指标变化检测 取待测心脏组织5 cm3，采用高速组织研磨仪将组织和0.9%氯化钠溶液混合制作成10%心肌组织匀浆，各取0.5 mL 10%匀浆加0.9%氯化钠溶液4.5 mL制备1%匀浆。采用组织硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量、微板法法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性、羟胺法检测T-SOD活性，以上观察指标均严格按照检测试剂盒说明书操作。

1.3.6 小鼠心脏组织形态学观察 将固定于甲醛溶液中的心脏组织石蜡包埋切片、厚度约4 μm，经脱蜡、乙醇脱水后，苏木精复染、脱水、透明、封片，将封片放在100倍光学显微镜下观察心肌组织并拍照。

1.3.7 心脏体质量比计算公式 心脏体质量比=小鼠心脏质量/小鼠体质量×100%。

1.4 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 芦丁干预PFOA暴露14 d小鼠体质量和心脏质量比较 各组小鼠体质量1～2 d比较差异无统计学意义(P>0.05)；3～14 d各组小鼠体质量有差异，且PFOA组小鼠体质量低于PFOA+芦丁组(P<0.05)；PFOA组和PFOA+芦丁组小鼠干预14 d心脏质量低于对照组，而PFOA+芦丁组高于PFOA组(P<0.05)；3组小鼠14 d心脏体质量差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

2.2 芦丁干预PFOA暴露14 d小鼠心肌TG、TC含量和血清LDH活性 PFOA+芦丁组小鼠14 d心肌血清LDH活性低于PFOA组(P<0.05)；而PFOA组与PFOA+芦丁组小鼠14 d心肌TG、TC含量差异均无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 芦丁干预PFOA暴露14 d小鼠心肌TG、TC含量和血清LDH活性

2.3 芦丁干预PFOA暴露14 d小鼠心肌MDA含量、GSH-PX和T-SOD 活性 PFOA组小鼠14 d心肌MDA含量高于对照组(P<0.05)，而PFOA组与对照组小鼠14 d心肌T-SOD、GSH-PX活性差异无统计学意义(P>0.05)；PFOA+芦丁组小鼠14 d心肌MDA含量低于PFOA组，但无统计学意义(P>0.05)。PFOA+芦丁组与PFOA组在小鼠14 d时心肌T-SOD活性上差异亦无统计学意义(见表3)。

表3 芦丁干预PFOA暴露14 d小鼠心肌MDA含量、GSH-PX和T-SOD活性

2.4 芦丁干预PFOA暴露14 d小鼠心肌组织形态学观察 对照组心肌纤维排列整齐，心肌细胞并未见萎缩或肥大；PFOA组小鼠表现出不同程度心肌细胞表现出肥大、坏死，心肌纤维扭曲、横纹模糊；如图中黑色箭头所示，PFOA处理组，部分心肌细胞胞核明显偏向细胞边缘。PFOA+芦丁组排列较为整齐，质内间观察到少量胶原纤维增生胞质，部分心肌细胞表现出心肌纤维扭曲轻微(见图1)。

3 讨论

全氟烷酸属于一类人工合成化合物，在国民生产及生活中都具有重要作用，但由于其广泛的使用，现已造成了持久性的环境污染，在人与动物健康方面也造成了很多影响[10]。PFOA是这类化合物的重要代表，它严重影响机体代谢稳定性，经过氧化物酶体增殖物活化受体活性在心肌损伤中发挥毒性作用[11]。研究[12]报道，PFOA暴露易造成的心肌损伤常表现在小鼠体质量、心脏质量及心肌组织形态学变化等方面。在本研究中，从体质量、心脏质量观察到，PFOA组小鼠体质量下降、心脏质量增加，而从组织病理学中发现PFOA暴露小鼠的心脏发生显著形态学改变，如纤维结构紊乱、心肌细胞肥大、坏死，胶原结缔组织增生等；此外，PFOA暴露明显增加了心肌TC含量及血清LDH活性与心肌MDA含量，在心肌细胞损伤时，大量LDH从细胞释放到血液。研究[13]报道，PFOA暴露所致的心肌损伤与氧自由基造成TG、TC过氧化，同时加快细胞中Ca2+负荷过大诱发不可逆性线粒体损伤密切相关。MDA是脂质过氧化产物，该含量在心肌发生过氧化损伤时呈现为高表达，本研究中PFOA组MDA含量高于对照组，与既往文献[14-15]报道相符。提示PFOA暴露对心脏具有毒性作用，可造成小鼠发生明显的心肌损伤。

临床研究[16-17]发现，芦丁在改善心肌缺血、抗氧化、心律失常，调低血清胆固醇水平、血小板聚集等多个方面具有作用。SONAM等[18]研究报道芦丁可改善心肌缺血再灌注大鼠的心功能，预防抗氧化损伤；PRAMANIL等[19]研究采用曲克芦丁干预蒽环类药物建立大鼠心肌损伤模型，结果发现芦丁对蒽环类药物诱发的大鼠心肌损伤具有保护作用；WANG等[20]研究发现，芦丁可降低心肌损伤大鼠SOD活性，增加MDA含量。

本研究发现芦丁对PFOA所致小鼠血清LDH升高及心肌组织结构损伤等有明显的改善作用。可在一定程度上减少MDA的生成。

综上所述，芦丁可显著改善PFOA造成的小鼠心肌损伤组织病理学变化，同时调控小鼠心肌MDA含量、血清LDH活性、GSH-PX活性，提示芦丁可缓解PFOA小鼠心肌组织损伤，抑制心肌纤维化，具有一定的抗氧化保护作用。