GSK-3β抑制剂对糖尿病肾病大鼠肾组织病理、NF-κB及TGF-β1的影响

王雪梅，陈海青

中国人民解放军联勤保障部队第九八一医院质量管理控制科，河北承德 067000

糖尿病肾病(DN)已成为我国除心脏疾病外的第二大疾病，临床症状主要为身体水肿和尿蛋白水平升高，而糖尿病作为一种代谢性疾病，使患者身体健康受到损伤，还会引起各种并发症，给患者心理和生理造成极大的负担[1-2]。糖尿病引起的肾损伤十分常见，主要表现在肾功能衰退会减少降糖物质的排泄，药物在机体内停留时间增加，这些药物大多数都在肾脏排泄，肾负担加重[3]。据不完全统计，我国每年由糖尿病患者转为DN患者的概率为三分之一，并有部分患者病情加重，甚至发展到肾病终期[4]。转化生长因子-β1(TGF-β1)作为调节细胞增殖及分化的重要因素，参与了许多生理学和病理学过程，可引起细胞外矩阵和基底膜的分解，DN患者肾损伤程度受TGF-β1表达水平影响[5]。随着医学领域的不断发展，核因子-κB(NF-κB)成为研究热点。作为核转录中最重要的因子之一，NF-κB参与了细胞的凋亡及炎性反应，炎症信号最先转入细胞膜中，通过细胞中I-κB激酶等途径增加NF-κB活性进行特异性识别，出现基因转录和调控引发病变[6-7]。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是涉及多个细胞信号传输路径的丝/苏氨酸激酶，其生物学功能复杂，除了参与糖代谢之外，GSK-3β还涉及细胞分化、增殖、炎性反应等过程。近年研究发现，GSK-3β抑制剂可减轻胰岛素抵抗，在DN的临床治疗中效果明显[8]。由此，本文探讨GSK-3β抑制剂对DN大鼠肾组织病理、NF-κB及TGF-β1的影响。

1 材料与方法

1.1模型建立和分组 将购自广东省医学实验动物中心的36只体质量为0.20～0.25 kg的SD大鼠随机分为Tz组(DN模型)、Ty组(GSK-3β抑制剂干预)和Wt组，各12只。Wt组大鼠正常饲养，Tz组、Ty组大鼠采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射，建立DN动物模型(不予喂食，空腹3 d后抽取大鼠尾部静脉血测血糖，血糖≥16.7 mmol/L视为合格糖尿病模型)。

1.2仪器与试剂 美国ENZO公司生产的STZ，AVIVA公司生产的小鼠抗NF-κB单克隆抗体，苏州巨能科技公司羊抗兔IgG，上海Superchip technology公司生产的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒等。

1.3方法

1.3.1干预及24 h尿蛋白测定 Ty组大鼠采用GSK-3β抑制剂(氯化锂)干预，Wt组及Tz组(DN模型)采用等量生理盐水腹腔注射。3组大鼠均继续饲养12 d。24 h尿蛋白定量处死大鼠前，收集3组大鼠禁食(正常喝水)24 h后的尿液，测定24 h尿蛋白。

1.3.2苏木精-伊红(HE)染色 将大鼠处死，取出双肾，甲醛溶液固定肾组织，乙醇溶液脱水，石蜡包埋后切片(厚度4 μm)，山羊血清封闭，苏木精和伊红染液复染，时间分别为6～8 min和10 s，于显微镜下观察Wt组、Tz组、Ty组肾组织结构改变情况。24 h大鼠的尿标本，运用Bradford法进行检测。

1.3.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测NF-κB表达水平 取肾组织，加入裂解液，制备组织匀浆，采用Trizol法提取总RNA。将总RNA反转录成cDNA，以β-actin为内参，按说明书进行实验，试剂盒购自上海Superchip technology公司生产的。反应条件：60 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，95 ℃ 5 min，循环次数40次，实验次数至少3次，用2-ΔΔCt计算NF-κB、TGF-β1的mRNA表达水平。见表1。

表1 PCR引物序列

1.3.4免疫组化检测TGF-β1表达 取石蜡包埋的肾组织，切片(厚度5 μm)，乙醇溶液脱水，滴加抗原消化液、修复液，应用山羊血清封闭，按1∶50加入一抗及二抗，恒温箱孵育30 min，磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次，选择3,3′-二氨基联苯胺染色，利用蒸馏水终染，苏木精衬染，脱水后可烘干，肾组织棕(褐)色为TGF-β1阳性表达，于光镜下进行观测。

1.3.5Western blot法检测NF-κB、TGF-β1变化 取石蜡包埋的肾组织，使用PBS洗涤，将1 mL裂解液与切碎的肾组织混匀，对肾组织匀浆进行蛋白测定，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)100 V电泳，Bradford法可来定量电泳产物，再移至PVDF膜，10%山羊血清封闭操作，一抗过夜4 ℃下孵育，待二抗孵育完毕后，使用TBST漂洗2遍，TBS漂洗1遍，每次10 min。使用增强化学发光法试剂来检测蛋白，暗室内曝光，Quantity One 4.0软件分析，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作内参，检测NF-κB、TGF-β1蛋白变化。

2 结 果

2.13组大鼠24 h尿蛋白定量 Tz组及Ty组大鼠24 h尿蛋白水平[分别为(118.53±21.68)mg/24 h、(76.54±10.23)mg/24 h)]均高于Wt组[(12.66±2.57)mg/24 h]，Ty组大鼠24 h尿蛋白水平低于Tz组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2HE染色结果比较 Wt组大鼠肾组织内细胞结构、形态较完整，未观察到增生、肥大的细胞。Tz组大鼠肾小球、系膜基质生长异常，毛细血管管腔、肾小管管腔凹陷、阻塞，伴有水肿间质。Ty组大鼠肾小球和肾小管病变程度较Tz组有明显好转。见图1。

注：A为Wt组大鼠肾组织染色图;B为Tz组大鼠肾组织染色图；C为Ty组大鼠肾组织染色图。

2.3各组大鼠NF-κB、TGF-β1 mRNA水平比较 Wt、Tz组及Ty组大鼠肾组织中NF-κB mRNA水平分别为(1.27±0.14)、(8.04±2.16)、(5.68±1.09)；TGF-β1 mRNA水平分别为(1.09±0.11)、(8.23±1.37)、(4.41±0.64)。Tz组及Ty组NF-κB、TGF-β1 mRNA水平高于Wt组，Ty组NF-κB、TGF-β1 mRNA水平低于Tz组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.43组TGF-β1阳性表达情况比较 免疫组化检测结果显示，Wt组TGF-β1阳性表达最低，Tz组TGF-β1阳性表达最高，且Ty组TGF-β1阳性表达较Tz组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：A为Wt组大鼠肾组织TGF-β1阳性表达；B为Tz组大鼠肾组织TGF-β1阳性表达；C为Ty组大鼠肾组织TGF-β1阳性表达。

2.5Western blot法检测NF-κB、TGF-β1蛋白变化 Wt组、Tz组及Ty组大鼠肾组织中NF-κB蛋白表达水平分别为(0.16±0.02)、(0.72±0.09)、(0.45±0.05),TGF-β1 蛋白表达水平分别为(0.24±0.02)、(0.81±0.11)、(0.36±0.04)。Ty组及Tz组NF-κB、TGF-β1蛋白表达水平高于Wt组；Ty组NF-κB、TGF-β1蛋白表达水平低于Tz组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 Western blot检测NF-κB、TGF-β1蛋白表达水平

3 讨 论

DN是全球糖尿病患者中发病率较高的微血管疾病，在我国DN的发病率逐年升高[9]。有研究表明，DN临床表现肾脏肥大、肾小球滤过率增高、肾小球内膜增厚，病情加重，研究表明，尿蛋白与DN发展有密切关系[10]。当人体血液中糖分升高时，体内糖代谢出现紊乱，会促进多元醇活化，激活蛋白酶通路会增加晚期糖基化的产生，使病情迅速发展，血液黏度增加，血管内皮组织活化，炎性因子增加，打破机体平衡，诱发微血管疾病的发生，最终发展为DN[11-12]。DN发展为终末期肾脏病后，治疗难度增加，治疗效果下降，因此，及时防治DN对肾组织的保护意义重大[13]。

通过观察大鼠24 h尿蛋白定量，Tz组大鼠较Wt组有明显上升，Ty组大鼠低于Tz组，但高于Wt组，GSK-3β抑制剂可降低大鼠尿蛋白水平。有研究表明，抑制GSK-3β活性，可降低DN大鼠血清纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)及蛋白尿水平，改善肾脏凝血纤溶状态，对肾脏起到保护作用。通过观察大鼠肾组织HE染色，NF-κB、TGF-β1表达发现，Wt组大鼠肾组织内细胞结构、形态较完整，未观察到增生、肥大的细胞，Tz组大鼠肾小球、系膜基质生长异常，毛细血管管腔、肾小管管腔凹陷、阻塞，伴有水肿间质；Ty组大鼠肾小球和肾小管病变程度较Tz组有明显好转；与Wt组比较，Tz组NF-κB、TGF-β1表达水平明显升高，与Tz组比较，Ty组NF-κB、TGF-β1表达水平低于Tz组，较Wt组有所升高。说明注射GSK-3β抑制剂后TGF-β1明显降低。有研究证实，持续高血糖和胰岛素抵抗可导致活性氧及糖基化终末产物增加，进而启动炎性反应、内皮功能障碍激活NF-κB信号通路，高糖作用下NF-κB活性增强，导致TGF-β1趋化因子和细胞黏附分子等细胞因子释放增加[14]。过量的TGF-β1、IL-6及MCP-1可导致内皮细胞凋亡，炎症水平升高，NF-κB可影响血管内皮生长因子等多种信号通路的表达，导致血管细胞损伤及血管生成，促进DN的发生[15]。有研究证实，在患者体内NF-κB、TGF-β1表达水平呈上升趋势，会使DN患者病情加重，同时NF-κB是检测疾病发生的重要指标之一，在脏器损伤中扮演重要角色，在炎症或肾脏损伤后，NF-κB水平上升迅速[16]。TGF-β1属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族，在细胞增殖、细胞分化过程中起调节作用，促进细胞外矩阵合成，在多种疾病中呈过表达趋势[17-18]。TGF-β1/2可作为DN的预后指标使用，TGF-β1负调节可以对肾组织关联成纤维细胞的分化产生抑制作用，并且可以阻碍疾病微环境的形成减缓病情[19]。有研究证实，DN患者受到TGF-β1过表达影响疾病呈恶化状态，免疫功能也会受到抑制，肾损伤程度明显加重[20-21]。TGF-β与其他因子共同激活了NF-κB，导致巨噬细胞聚集向M1极化促炎性反应，GSK-3β是一种存在于真核细胞中、维持上皮细胞结构和表型所必需的多功能蛋白激酶，具有调控该酶催化糖酵解、参与胰岛素、调控炎性反应等功能[22]。抑制GSK-3β活性可改善胰岛素抵抗，抑制高糖介导的系膜细胞凋亡。有研究表明，抑制GSK-3β可调控RANK-RANKL的表达与活性，从而下调了NF-κB的表达，减轻炎性反应，缓解DN病变进程[23]，这与本研究结果相似。

综上所述，GSK-3β抑制剂能减缓糖尿病大鼠肾损伤程度，降低肾组织中NF-κB和TGF-β1的表达。