丹皮酚对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及对TLR4、IL-23及SOD活性的影响*

丁华胜，王永剑

南方医科大学深圳医院急诊科，广东深圳 518101

心肌缺血再灌注损伤是临床上最常见的病理生理过程之一，近年来有研究表明，在急性心肌缺血再灌注损伤时血浆中脂质过氧化物增多,而心肌中的超氧化物歧化酶(SOD)因合成减少、被灌注液冲洗及消耗增加而减少,当补充外源性的SOD时则减轻氧自由基的损伤,从而降低致死性心律失常[1-2]。白细胞介素(IL)-23是一种促炎细胞因子，作为IL-12家族成员，其广泛参与心肌梗死、银屑病、肿瘤等多种疾病过程并发挥着重要作用[3-4]。Toll样受体4(TLR4)是天然免疫系统识别病原微生物的主要受体，有研究表明 TLR4与IL-23参与了心肌缺血再灌注损伤中的致病过程[5-7]。丹皮酚具有神经保护、抗过敏、抗肿瘤、抵抗脂质过氧化、镇痛消炎等效能,对于心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌组织，丹皮酚具备一定的保护性功能[8-11]。本研究探讨丹皮酚对心肌缺血再灌注损伤保护中TLR4、IL-23及SOD的影响，分析其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 动物清洁级成年SD雄性大鼠 52 只，体质量 230～300 g，全部购自武汉大学实验动物中心。

1.2分组和给药 把实验大鼠随机分成假手术组、模型组、丹皮酚低剂量组(15 mg/kg)、丹皮酚高剂量组(30 mg/kg)，每组13只SD大鼠。其中丹皮酚高、低剂量组在术前10 d均采用丹皮酚灌胃给药的方法建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，每天给药1次。以上4组大鼠成功造模3 h后立即处死，采集、收集各组血液与心脏标本后进行相关指标检测。

1.3仪器与试剂 TLR4 兔多克隆抗体、IL-23兔多克隆抗体由英国 abcam 公司提供;水合氯醛为山东鲁南制药厂产品；99%纯度的丹皮酚，为Sigma公司产品，由0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)制备；2,3,5-氯化三苯基四氮唑试剂由浙江省华东医药股份公司提供。

1.4大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的建立 将戊巴比妥钠(用量为30 mg/kg)注入大鼠腹腔内，进行麻醉处理，大鼠呈仰位固定，待完成气管插管并与人工呼吸机连接后，从胸骨左侧 3 mm 第4肋间处进行开胸操作，分离心包，暴露心脏，接着用4-0丝线穿过左心耳下缘冠脉前降支起始部约3 mm 处，在结扎线下置入乳胶管直径0.15 cm，之后收紧结扎线后打结，阻断45 min后，将结扎线松开，然后进行3 h再灌注[11]。通过大鼠心电图结果来判断大鼠心肌缺血再灌注损伤模型是否建立成功，如果发现ST-T抬高，待放开丝线，ST-T又有所降低则大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建立成功。

1.5检测方法

1.5.1心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死面积测定 再灌注3 h后立刻对冠状动脉进行结扎处理，并在颈动脉部位注入伊文斯蓝 1.5 mL，随后将心脏取下用磷酸盐缓冲液进行冲洗，将脂肪、心房、血管等无关组织丢弃，用滤纸把左心室水分去除后放置在冰箱-20 ℃内进行冷冻处理。然后将心尖处朝上，对心脏进行切片处理，共切5片，厚度一致，采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑试剂染色法测定心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死面积，无蓝染为危险区,灰白色为梗死区，由此计算出心肌梗死面积占危险区心肌面积百分比。

1.5.2血清SOD活性测定 有效再灌注3 h后，在腹主动脉位置采集血液标本，然后实施以2 500 r/min 15 min离心处理，将获得的血清移至EP管内，置于冰箱-20 ℃内待检。借助分光光度计，通过比色法分别在440 nm、660 nm下对吸光度(A)值进行检测，同时对SOD活性进行测定，严格遵循试剂盒说明书操作。

1.5.3TLR4阳性细胞平均积分光密度(AIOD)测定 通过随机方式，在各组中选择5 只SD大鼠，采用免疫组化检测TLR4，若借助光镜，观察心肌细胞胞浆见均质颗粒，其显示为棕黄色，则判定为阳性细胞。借助显微图像采集系统，对各张免疫组化切片，通过随机方式确定出5个高倍视野(×400)，再通过专业图像分析软件Image ProPlus 5.0计算TLR4阳性细胞AIOD。

1.5.4大鼠心肌组织IL-23 蛋白水平检测 采用蛋白质免疫印迹法，对大鼠心肌组织IL-23蛋白水平进行测定。对实验动物进行3 h再灌注处理后，采集处于结扎线水平以下的左心室心肌组织，然后参照相对分子质量配制12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后转膜,用5%的脱脂奶粉封闭,4 ℃孵育一抗过夜,用IL-23蛋白对应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育后,采用电化学发光法显色，以β-actin为内参计算上述各组IL-23蛋白水平。

2 结 果

2.1丹皮酚对心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响 丹皮酚低剂量组梗死面积占危险区心肌面积百分比为(31.23±2.81)%、丹皮酚高剂量组梗死面积占危险区心肌面积百分比为(27.92±2.53)%，与模型组梗死面积占危险区心肌面积百分比[(36.48±3.76)%]比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2各组大鼠心肌组织IL-23蛋白、TLR4阳性细胞AIOD、SOD活性比较 模型组、丹皮酚低剂量组、丹皮酚高剂量组大鼠心肌组织IL-23蛋白水平、TLR4阳性细胞AIOD、SOD活性与假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；丹皮酚低剂量组、丹皮酚高剂量组大鼠心肌组织IL-23蛋白、TLR4阳性细胞AIOD、SOD活性与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠心肌组织IL-23蛋白、TLR4阳性细胞AIOD及SOD活性比较

3 讨 论

心肌缺血再灌注损伤的机制复杂，在其病发过程中，氧自由基(OFR)、钙超载、炎性反应等均有所参与，在炎性反应发生的同时，数量可观的OFR及细胞因子产生，从而提高血管通透性以及引发水肿。药物预处理的实施，可促进血、氧供应不足下心脏耐受力的增强，使得由心肌缺血再灌注损伤造成的心肌损伤受到更为有效的保护[12-13]。本研究中通过丹皮酚预处理保护心肌缺血再灌注损伤功能进行观察，发现在丹皮酚作用下，减少TLR4阳性细胞AIOD及前炎性细胞因子IL-23的释放、SOD的合成增加使得减轻了氧自由基的释放，降低了心肌梗死的面积，实现对心肌缺血再灌注损伤的保护。

SOD作为机体内主要的抗氧化酶及超氧自由基清除剂，此物质活性反映出在清除自由基方面组织所具备能力。本研究显示，与假手术组比较，模型组SOD活性明显减少，这是因为缺血再灌注中心肌中的SOD合成减少、消耗增加、甚至部分被灌注液冲洗,说明本研究制作的心肌缺血再灌注模型成功。另外，与模型组比较，发现丹皮酚低剂量组、丹皮酚高剂量组SOD活性均明显升高，说明高、低剂量丹皮酚能够增强缺血再灌注心肌中的SOD活性、减轻自由基的损伤，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。

Toll样受体在巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等免疫细胞中大量存在，为各种病原微生物的识别受体启动宿主防卫反应。TLR4是人类与免疫炎症密切相关的信号转导受体蛋白[6,14]。IL-23属于一类促炎细胞因子,其大多产生自巨噬细胞及激活态树突状细胞，其受体大量分布在自然杀伤细胞、巨噬细胞、T细胞和树突状细胞等细胞表面,目前有研究证实，IL-23经由TLR4对心肌缺血再灌注损伤施以调控作用[15-17]。本研究结果表明丹皮酚能够明显降低模型组的心肌缺血TLR4阳性细胞的表达，防止缺血再灌注损伤进一步恶化。另外，丹皮酚能够使IL-23蛋白水平下调及SOD活性显著升高，对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用，此保护效应在丹皮酚高剂量组优势更显著。

综上所述，丹皮酚可使大鼠心肌缺血再灌注损伤的心肌组织内TLR4、IL-23蛋白水平下调，增加SOD活性，缩小大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌梗死面积，可在一定程度上有效保护心肌缺血再灌注损伤。