血清miR-200c-3p和miR-195-5p在卵巢癌中的表达及其对预后的预测价值

张小婷

上海市同仁医院妇产科，上海 200050

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，好发于50～60岁的女性，发病率高达45%，是排在第3位的妇科恶性肿瘤，近年来我国卵巢癌发病年龄呈年轻化趋势[1]。由于卵巢癌不易早期诊断，且肿瘤的生长速度快，多数患者就诊时病灶已扩散，预后较差，5年生存率较低[2]。因此，早期诊断、早期治疗对改善卵巢癌患者术后生存质量具有重要意义。微小RNA(miRNA)是一类非编码单链小RNA，为多功能小分子，可以在转录水平调控信使RNA(mRNA)，参与多种细胞病理和生理过程[2]。越来越多的研究证实，miRNA与卵巢癌发生、发展具有密切的联系，并且影响卵巢癌患者的预后[4]。一项高侵袭性乳腺癌研究发现，乳腺癌组织miR-200c-3p表达水平明显低于癌旁组织，miR-200c-3p表达升高可明显降低乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力[5]。有研究指出，miR-195-5p在胃癌、结直肠癌和胰腺癌等恶性肿瘤的形成与发展中发挥了重要作用[6-8]。而miR-200c-3p和miR-195-5p在卵巢癌中的表达情况及其对预后的影响仍不清楚。本研究通过检测卵巢癌患者血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平，观察其在卵巢癌发生、发展中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2012年1月至2016年1月在本院就诊并行卵巢癌根治术的患者116例作为卵巢癌组，年龄45～75岁，平均(52.34±12.61)岁；按照病理分级分为低分化16例、中分化29例和高分化71例；按照组织类型分为浆液性88例、黏液性12例、内膜样16例；国际妇产科联盟(FIGO)分期分为Ⅰ～Ⅱ期50例、Ⅲ～Ⅳ期66例；按照淋巴结有无转移分为无淋巴结转移31例、有淋巴结转移85例。另选取同期在本院行卵巢良性病变手术患者45例作为良性对照组，年龄46～76岁，平均(53.16±11.29)岁。以及同期在本院体检健康妇女30例作为健康对照组，年龄45～73岁，平均(52.19±10.76)岁。纳入标准：(1)卵巢癌组和良性对照组患者均经手术确诊为卵巢癌和卵巢良性病变；(2)均签署知情同意书。排除标准：(1)术前经过化疗、放疗或靶向治疗的患者；(2)围术期发生死亡患者；(3)合并心、肝、肾等重要脏器功能损害及自身免疫性疾病患者；(4)慢性感染性疾病患者；(5)出血性或者血栓性疾病患者。本研究经医院伦理委员会审核通过。各组年龄等基线资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1血液标本留取 健康对照组体检时，以及卵巢癌组和良性对照组入院后及手术后2周，抽取肘静脉血5 mL。将血液标本于3 000 r/min离心15 min(离心半径15 cm)，取上清液置于除酶管内，-70 ℃冰箱中保存待测。

1.2.2miRNA检测 采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平。(1)总RNA提取：取受试者血清400 μL，采用TaqMan RNA试剂盒进行血清总RNA提取。反转录引物由上海化生有限公司合成，miR-200c-3p的上游引物为5′-GGG AAC ACA CCT GGT TAA C-3′，下游引物为5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；miR-195-5p的上游引物为5′-GAT AGC AGC ACA GAA ATA TTG GC-3′，下游引物为5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′，内参U6的上游引物为5′-TGC GGG TGC TCG CTT CGG CAG CA-3′，下游引物为5′-CCA CTG CAG GGT CCG AGG T-3′。(2)miRNA的检测：取反转录酶1 μL，RNA 5 μL和3 μL引物，在15 μL的反应体系中，采用美国ABI TaqMan PreAmp Master Mix进行扩增，扩增条件为16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min，取反转录产物按操作说明书配制20 μL反应体系，放置在荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件为95 ℃预变性15 min，94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，连续40个循环。每个样品检测3次，以2-ΔΔCt表示miRNA的相对表达水平。

1.2.3随访 根据卵巢癌患者随访2年内的生存情况，将其分为生存组与死亡组。

1.3观察指标 观察各组血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平，卵巢癌组血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平与临床指标、2年内出现死亡的相关性及其预测2年内出现死亡的灵敏度和特异度。

2 结 果

2.1各组血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平比较 卵巢癌组血清miR-200c-3p表达水平明显高于良性对照组和健康对照组，而良性对照组明显高于健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，卵巢癌组手术后血清miR-200c-3p表达水平为(1.26±0.96)，手术前血清miR-200c-3p表达水平为(3.86±1.24)，差异有统计学意义(P<0.05)。卵巢癌组血清miR-195-5p表达水平明显低于良性对照组和健康对照组，而良性对照组明显低于健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。卵巢癌组手术后血清miR-195-5p表达水平为(3.45±1.27)，手术前血清miR-195-5p表达水平为(0.98±0.34)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组手术前血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平比较

2.2卵巢癌组血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平与临床指标的关系 Logistic回归分析显示，血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平与卵巢癌组年龄、肿瘤直径、组织类型无关(P>0.05)，与病理分级、FIGO分期、糖类抗原125(CA125)和淋巴转移有关(P<0.05)。见表2。

表2 卵巢癌组血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平与临床指标的关系

2.3随访2年后卵巢癌组血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平比较 随访2年后，卵巢癌组中死亡组血清miR-200c-3p表达水平明显高于生存组，而死亡组血清miR-195-5p表达水平明显低于生存组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 随访2年后卵巢癌组血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平比较

2.4血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平与2年内卵巢癌死亡的关系 卵巢癌组血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平联合检测的灵敏度、特异度及ROC曲线下面积(AUC)高于血清miR-200c-3p、miR-195-5p表达水平的单独检测，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。卵巢癌组血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平在预测2年内出现死亡的效能见表4。

注：1为miR-200c-3p；2为miR-195-5p；3为miR-200c-3p+miR-195-5p。

表4 卵巢癌组血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平在预测2年内出现死亡的效能

3 讨 论

卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，早期症状不明显，即使有症状也无特异性，缺乏早期诊断和预后判断的指标，尤其对预后的判断方面仍无特异性指标。miRNA是一种由17～25个核苷酸组成的高度保守的内源性单链非编码RNA，与靶基因的非编码区特异性结合，对基因的转录具有明显的调控作用，在细胞增殖、分化和凋亡等病理生理过程具有重要作用。

本研究结果显示，卵巢癌组血清miR-200c-3p表达水平明显高于良性对照组和健康对照组，并且发现卵巢癌组患者手术后血清miR-200c-3p表达水平明显较术前明显降低，提示血清miR-200c-3p表达水平与卵巢癌的发生、发展具有密切关系。miR-200c-3p属于miR-200家族成员，定位于12p13染色体，具有促进肿瘤的侵袭、增殖和转移作用。有研究发现，miR-200c在胃癌患者的血浆中呈高表达，与淋巴结转移和预后具有明显相关性，并且miR-200c在诊断胃癌方面具有较高的灵敏度和特异度[9]。本研究还发现，血清miR-200c-3p的表达与卵巢癌患者的病理分级、FIGO分期、CA125和淋巴转移具有明显相关性，提示miR-200c-3p表达水平与卵巢癌的恶性程度、肿瘤淋巴转移、分期和预后有密切关系，与文献[10-11]研究结果类似。有研究发现，miR-200c-3p基因具有双重角色，在乳腺癌未发生转移前主要表现为抑癌基因作用，而在发生转移后表现为促癌基因的作用[11]。本研究还发现，死亡组血清miR-200c-3p表达水平明显高于生存组，并且血清miR-200c-3p表达水平在2年内预测死亡的灵敏度为70.3%，特异度为94.2%，AUC为0.866，提示血清miR-200c-3p表达水平在诊断卵巢癌具有较高的特异度。其他研究发现，血清miR-200c-3p表达水平与肿瘤分期和远处转移具有明显的相关性，而且血清miR-200c-3p表达水平在评价卵巢癌的诊断和预后具有一定的价值，并认为是卵巢癌新的生物学标志物[12]。

本研究结果显示，卵巢癌患者血清miR-195-5p表达水平明显低于良性对照组和健康对照组，手术后血清miR-195-5p表达水平较手术前明显提高，说明miR-195-5p基因来源于卵巢癌有关，类似抑癌基因，对卵巢癌具有明显的保护作用。本研究还发现，卵巢癌患者血清miR-195-5p表达水平与病理分级、FIGO分期、CA125和淋巴转移具有明显相关性，说明血清miR-195-5p表达水平与肿瘤分期和分化程度相关。在一项膀胱癌和癌旁组织进行miRNA芯片筛选的过程中发现，膀胱癌组织血清miR-195-5p表达水平明显降低，同样有学者在膀胱癌多种细胞系的研究中发现，血清miR-195-5p表达水平出现明显下降，并发现血清miR-195-5p表达水平降低是膀胱癌组织的重要特征，并在体外转染miR-195-5p质粒后，肿瘤的增殖活性和抗凋亡能力明显减弱，说明miR-195-5p是膀胱癌的抑瘤基因[13]。在一项乳腺癌的研究中发现，miR-195-5p能够通过抑制细胞周期蛋白，从而抑制癌细胞的增殖和迁移[14]。而在一项宫颈癌的研究中发现，miR-195-5p能够明显抑制血管内皮细胞生长因子的表达，从而抑制癌细胞的增殖、转移[15]。在一项胃癌的研究中发现，胃癌组织中血清miR-195-5p呈低表达，并发现miR-195-5p是胃癌的独立预后因素[16]。本研究还发现，随访2年后，卵巢癌组中死亡组血清miR-195-5p表达水平明显低于生存组，预测2年内死亡的灵敏度为92.2%，特异度75.0%，AUC为0.876，说明诊断效能较高。

本研究发现，血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平在预测卵巢癌2年内死亡方面具有较高的灵敏度和特异度，且二者联合检测的灵敏度、特异度、AUC明显高于血清miR-200c-3p、miR-195-5p表达水平的单独检测。说明血清miR-200c-3p和miR-195-5p表达水平联合检测对卵巢癌预后有很高的预测价值，miR-200c-3p基因相当于促癌基因，而miR-195-5p基因相当于抑癌基因，二者是否存在某种平衡，有待进一步研究。

总之，miR-200c-3p和miR-195-5p参与了卵巢癌的发生、发展，在预测卵巢癌2年内死亡方面具有较高的灵敏度和特异度。