基于谱效关联技术的中药研究现状△

晏朝操，张建锋

1.德江县民族中医院，贵州 铜仁 565299；2.国药集团同济堂(贵州)制药有限公司，贵州 贵阳 550009

中药无论是单味药还是中药复方，其成分繁多而复杂，中药化学成分不及化学药清楚明确。在国内外，中药指纹图谱被认为是一种切实可行的质量控制方法，整体上很好地控制中药的质量。如何保证中药的临床疗效呢？卫强等[1]在总结前人基础上提出，将中药指纹图谱中化学成分的变化与中药药效结果联系起来，建立中药化学成分与其疗效一致的中药质量标准。有学者又在其基础上将中药指纹图谱和药效结合起来进行研究，建立了谱效关联学[2]、谱效关系学[3]、中药谱效学[4]等学科。中药谱效学是在中医药理论现代研究的基础上，以中药指纹图谱为基础，以效应及效应体学为主要内容，从中药指纹图谱的多种(或多组)化合物中，应用生物信息学方法，建立中药指纹图谱与中药质量疗效内在研究关系的一门学科[5-7]，广泛应用于中药材、中药饮片和中药制剂质量评价研究(见表1)。

表1 谱效关联技术在中药评价研究中的应用

1 中药指纹图谱与药效的研究

迄今为止，国内外研究者对谱效关联进行了大量的实验探索。肖云芝等[23]采用高效液相色谱-二极管阵列检测(HPLC-DAD) 测定了12个产地鳖甲药材样品，研究其对LX-2细胞的抑制效果，发现12个产地鳖甲药材HPLC指纹图谱中共有7个特征共有峰，其中峰2、5与LX-2 细胞抑制效果(A 值)呈现中等程度相关，峰4的相关性最强；并建立了共有模式，进行PCA，峰4的量对鳖甲质量有着重要的影响。高燕等[24]根据 10批金银花样品的验证结果建立数学模型，半数有效浓度(EC50)计算值与实测值偏差率全部在10%以内，其中7个模型(占70%)的偏差率在5%以内。Zeng等[25]通过气质联用(GC-MS)建立广西莪术挥发油指纹图谱，并对广西莪术挥发油的抗肿瘤作用进行研究，在获得的挥发油GC-MS 指纹图谱特征峰面积与对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用数据的基础上，确定了广西莪术挥发油“有效组分群”指纹特征对药效贡献的大小，为中药谱效关联的建立、中药质量控制和药效评价标准的制定提供了新的思路和方法。

2 谱效关联的研究内容和方法

2.1 单味中药物质基础研究

在中药研究中，单独使用某一成分含量作为单味药的质量控制指标，具有片面性。根据单味中药研究目标不同，包括产地、种属、季节、药用部位、提取方法、检测方法、炮制方法等差异性的药材作为研究对象，将指纹图谱和药效学实验数据相结合，运用数理统计学的知识，分析中药的化学成分与药效的关联性。王宏虹等[26]以人肝癌细胞株HepG2为药效模型，应用噻唑蓝比色法(MTT)测定33批不同产地两面针药材提取物的抗肝癌活性，采用逐步后退法将量化特征峰面积与MTT 法测得两面针提取物抗肿瘤活性的结果结合，构建两面针药材提取物抗肝癌的谱效关系方程，可较准确地预测两面针药材提取物的抗肝癌活性。Xiao等[27]利用超高效液相色谱-质谱结合指纹图谱研究铁苋属药材的抗菌活性，该模式为中药研究提供新的研究方法和思路。

2.2 中药复方物质基础研究

由于中药复方药味较多，化学成分复杂，其不同于单味中药的物质基础研究，有自己独特的研究方式和方法，采用拆方进行研究，主要有单味药研法、撇药分析、分组研究、据有效部位或成分的分组研究、配伍研究、应用数理原理指导拆方研究等思路和方法[28]。多以不同产地、不同炮制、不同配伍组合或不同提取方法制备的复方作为研究对象，进行指纹图谱研究和药效学研究，再通过多种统计分析方法进行数据处理，建立谱效关系模型，确定复方中的主要活性成分群。刘青萍[29]运用PCA和GRA对实验结果进行分析，发现脑健片和补阳还五汤样品共有峰排名均大于其各自的特有峰，且保留时间为20.649、6.474、26.404 min的化学成分对神经功能评分、脑梗死面积、脑干湿比、周期蛋白Cyclin B1和Cyclin B2的贡献度排在前5位。李金兵[30]运用GC-MS法及多种关联分析法，成功寻找到11个抗抑郁的活性成分(莰烯、苍术酮、藁本内酯、棕榈酸、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ等)，从而为逍遥散的质量控制与药效物质基础研究提供了有价值的参考。

2.3 谱效关联与其他方法相结合

谱效关联与一测多评法和化学计量学等方法结合，进行指纹图谱和药效学研究。李婷婷等[31]在现有的中药材质量控制研究方法的基础上，提出“谱效关系+一测多评”的研究思路，即将谱效关系与一测多评相结合，为中药材质量控制研究提供方法和新思路。林芳等[32]应用一测多评法以绿原酸为参照内标，通过相对校正因子对松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、京尼平甘酸进行含量测定，并建立杜仲多指标HPLC指纹图谱，标定了12个共有指纹峰，为更全面科学地评价杜仲药材质量提供技术支撑。段小菊[33]利用化学计量学方法，分别建立了基于HPLC指纹图谱和近红外光谱(NIR)指纹图谱与抗氧化活性之间的白花丹参谱效关系模型，挖掘与抗氧化活性有显著相关的特征峰或光谱特征信息，为白花丹参药材的质量控制和评价提供参考。

3 谱效关联的数据处理方法

3.1 相关分析

相关分析研究现象之间是否存在某种依存关系，并对具体有依存关系的现象探讨其相关方向以及相关程度，是研究随机变量之间相关关系的一种统计方法[34]。张静等[35]采用结扎大鼠冠状动脉致急性心肌缺血的模型，运用双变量相关分析(BCA)和多元回归分析(MRA)，将超临界提取物(AC-SFE)与红花各配伍组合的药效数据与指纹图谱共有峰的相对峰面积相关联，并采用LC-MS指认色谱峰。共指认出16个色谱峰，其中12个是相关峰。AC-SFE 中的阿魏酸(峰13)、洋川芎内酯H(峰15)等峰可能是抗心肌缺血的药效物质；而峰8可能不能缓解心肌缺血。郑林等[36]研究荭草中花穗、带叶嫩枝和粗茎对H2O2诱导心肌H9c2细胞氧化损伤的保护作用，探讨其抗心肌缺血的药效物质基础；将各组合物活性信息与其相应的UPLC指纹图谱化学信息进行相关性分析研究，推测药效物质基础。通过谱效研究推测了荭草抗氧化损伤的活性成分，为荭草药材深层次研究开发奠定一定的实验基础。中药谱效关联研究主要是针对中药指纹图谱与药效两变量之间的关系，故常使用双变量相关性分析进行研究，适合从不严格的数据关系中判断其关系的紧密程度。

3.2 回归分析

回归分析是确定2种或2种以上变量间相互依赖的定量关系的一种统计分析方法，运用十分广泛。回归分析按照涉及的自变量的多少，可分为一元回归分析和多元回归分析；按照自变量和因变量之间的关系类型，可分为线性回归分析和非线性回归分析[37]。李友等[38]采用动态浊度法和HPLC获取板蓝根三氯甲烷部位指纹图谱，应用多元线性回归等统计方法，将抗内毒素活性参数半数抑制浓度(IC50)与HPLC指纹图谱共有峰的标准化峰面积比值相关联。李鹏等[39]采用小鼠痛经模型并结合GC-MS，对桃红四物汤及其单味药石油醚部位进行筛选；桃红四物汤的石油醚部位有显著的调经止痛作用。桃红四物汤的亲脂性化学成分主要为脂肪酸类成分。运用回归分析与相关分析对23号峰、24号峰(十八碳烯酸)、45号峰(花生酸)和61号峰(二十七烷)进行研究，发现亚油酸在延长扭体潜伏期和减少扭体次数方面起主要作用，而其他3个峰对镇痛效果有一定的协同作用，在一定程度上较客观地分析化学物质与药效之间的关系。回归分析是定量描述自变量对因变量的贡献率，回归系数越大影响越大，反之越小。在研究应用中，中药谱效关联多运用多元综合分析方法。

3.3 成分分析

PCA是将多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量的一种多元统计分析方法。又称主分量分析。胡晓燕等[40]采用管碟法，以抑菌系数作为评价指标，检测板蓝根总提取物、总有机酸部位、总生物碱部位、总核苷部位、总蒽醌部位对大肠杆菌AG100A 的抑制作用，确定抑菌活性最强部位后，建立10 批不同产地板蓝根样品的HPLC 指纹图谱，应用PCA将HPLC 指纹图谱共有峰的峰面积与抑菌系数进行相关分析。Kong等[41]利用PCA、HCA与多元相关分析方法，分别建立了基于HPLC指纹图谱与抗抗菌之间的板蓝根的乙酸乙酯提取物谱效关系模型，挖掘与抗菌性有显著相关的特征峰或光谱特征信息，为板蓝根药材的质量控制和评价提供新方法。在谱效关联研究中，适合先采用PCA筛选出主要药效组分，再结合其他数据处理方法进行研究。

3.4 灰色关联分析

对2个系统之间的因素，其随时间或不同对象而变化的关联性大小的量度，称关联度。在系统发展过程中，如果2个因素变化的趋势存在一致性，即同步变化程度较高，可谓两者关联程度较高；反之，较低。因此，GRA是指因素之间发展趋势的相似或相异程度，亦称“灰色关联度”，看成衡量因素间关联程度的一种方法[42]。耿媛媛等[43]采用HPLC建立二神丸不同提取部位的指纹图谱，以不同提取部位对番泻叶所致急性腹泻小鼠腹泻指数的影响研究其止泻作用，采用GRA法建立其谱效关系，建立的二神丸不同提取部位高效液相色谱指纹图谱方法较简单，易重复，为更好评价二神丸的质量提供参考。杨英来等[44]用控食和疲劳的方法制备小鼠气虚模型，比较当归不同提取部位对气虚小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能及免疫器官等的影响，筛选当归补气药效部位；用GRA法将补气作用较佳的各批当归药材70%乙醇提取部位(醇提物)HPLC 特征图谱各共有峰的峰面积与补气药效数据相关联，研究谱效相关性。如果中药的组分缺失信息比较多，适合运用GRA进行研究，与其他的分析方法比较，GRA要求的数据少，对数据的要求较低，原理简单，易于掌握和理解。

4 谱效关联的发展前景

4.1 采用现代的分析技术

中医药谱效关联的研究是目前中医药研究行业的一个热点，是中医药研究倡导的新思想。采用现代分析技术，是实现中药指纹图谱完成化学成分分离、结构鉴定的重要手段，也是对谱效关联研究的必要方法，如采用GC-MS[45]、多种液质联用技术[高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[46]、HPLC-DAD[47]、高效液相色谱-蒸发光散射法(HPLC-ELSD)[48]、高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱法(HPLC-Q-TOF-MS)[49]、超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱法(UPLC-Q-TOF-MS)[50]、超高效液相色谱-离子阱/飞行时间质谱法(UPLC-IT-TOF-MS)[51]等。经过对中药化学成分进行分离鉴定之后，再结合谱效关系的研究方法，确定中药的物质基础群或者有效组分群。

4.2 应用合理的数据处理方法

在中药谱效关联的研究中，选择科学合理数据处理方法极为重要，谱效关联研究的核心内容是合理的数据处理方法。在中药谱效关联的研究过程中，包括PCA、相关分析、逐步后退法、GRA、回归分析、神经网络分析、化学计量学与计算机编程模拟等数据处理方法；数据挖掘技术也是作为一个从海量数据中获取知识的有力工具，采用合理的数据挖掘模型及算法，能有效地推动中医药信息化的进程。每一个方法都有其优点和局限性，合理利用每个方法的优点，避免其局限性，才是中医药研究的关键所在。

4.3 选择有针对性的药理模型

在研究过程中，选择合理的药理模型对于药效研究更为重要，中药药理研究有较多模型，如抗炎、镇痛、抗高血压、抗胃溃疡、免疫性肝炎模型等。不同的药理模型得到不同的药效实验数据。合理的药理模型，能很好地指导药效研究。药理模型在研究过程中，研究对象不要选择离体的组织或者器官，最好选择整体动物，评价药效更加客观、合理、全面。将中药谱效结合血清药物化学[52]、代谢组学[53]、蛋白组学[54]等新兴学科，能够使研究成果更加规范、合理，使谱效关联更加科学、真实、可靠。

4.4 谱效关联的前景

谱效关联是指纹图谱研究深层次的科学研究模式，其是将中药药效与指纹图谱紧密结合建立的中药体内质量的指纹图谱，为中药复方制剂药效物质的研究和探索提供新思路、新方法；同时，可以整体反映中药多成分和生物活性成分数据信息，提高中药及复方制剂的质量评价标准，阐释中药化学成分与药效之间的关系，为建立系统全面的中药谱效关系模型提供理论依据，具有非常重要的理论与现实意义。但该方法研究仍有一定的局限性，随着科技进步和中医药迅速发展将不断对其进行补充和完善。伴随着多学科的交叉与融合，数据处理技术和检测方法有日新月异的发展，谱效关联技术对解释中药物质基础、提取分离、药效筛选等方面贡献卓著，为推动中医药标准化、现代化和国际化奠定坚实基础。