268份人类免疫缺陷病毒抗体待确定样本的检测结果分析

孟梦，王超，吴伟，王媛媛

北京市东城区疾病预防控制中心， 北京 100050

艾滋病(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)是由感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)所致。HIV攻击人体的免疫系统，大量破坏CD4+T细胞，使人体易于感染机会致病微生物[1]，病死率较高。由于HIV变异迅速，目前尚无彻底清除病毒的药物，同时病毒变异亦给疫苗的研发造成很大困难[2]。艾滋病已成为严重危害人体健康的公共卫生问题，因此早期检测发现潜在的HIV感染者是该病防治工作的重中之重。我国主要采用HIV抗体血清学检测方法进行实验室监测，检测通常分为筛查实验和补充实验。补充实验包括核酸检测实验和确证实验，其中蛋白质印迹法(Western blot，WB)是目前广泛使用的抗HIV抗体确证实验，结果分为 HIV-1抗体阳性、 HIV抗体阴性和 HIV抗体不确定，其中HIV-1抗体阳性是诊断HIV感染的金标准[3]。为了提高实验室的HIV抗体检测能力，了解艾滋病监管场所和各医疗机构筛查的抗体待确定样本的确证情况及不同检测试剂和方法对确证结果的影响，本研究对送检到我实验室的268份抗体待确定样本进行了检测结果分析，期望对艾滋病的防治提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 样本

北京市东城区所辖监管场所、自愿咨询检测门诊(Voluntary Counseling and Test，VCT)和医疗机构的筛查实验室上送的2016年全年经化学发光法、酶联免疫吸附实验(ELISA)、胶体硒法检测的HIV抗体待确定样本268份，其中男性215份、女性53份。

1.2 仪器与试剂

ProfiBlot-T48全自动蛋白印迹仪由奥地利TECAN公司生产，经检定校准合格。HIV-1+HIV-2抗体检测试剂盒(IMT HIV-1/2确证试剂盒)由上海英旻泰生物技术有限公司生产，试剂盒在有效期内且质控合格。

1.3 方法

WB采用间接法检测样品中的抗HIV-1/HIV-2特异性抗体。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳把分子量大小不等的HIV-1蛋白分离开来，经过一系列处理后，硝酸纤维素膜显示与特异抗原结合的抗体条带，从而确证抗体存在。严格按照试剂说明书和实验室标准作业程序(Standard Operation Procedure，SOP)进行WB确证实验。根据出现条带情况，按《全国艾滋病检测技术规范》(2015)[3]的规定并结合试剂盒说明书进行判定。每次实验均设置阴性、阳性和弱阳性对照，判读结果由2 名工作人员共同完成。

1.4 统计学方法

使用 Excel 建立数据库，采用SAS软件进行卡方检验和Fisher精确概率,以P<0.05 为差异有统计学意义，P<0.01 为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 待确定样本的WB确证实验结果

对送检至本实验室的268份经初筛抗体待确定样本进行WB确证实验，其中HIV-1抗体阳性170份，确证阳性率为63.43%；阴性样本51份，阴性率为19.03%；不确定样本47份，不确定率为17.54%。对47份不确定样本中的6份从2016—2019年进行了不间断的随访，最后确认有3份阳转，3份已予排除，其中不确定带型p24、p17p24、p31gp120gp160各阳转1份。

2.2 不同送检单位样本确证阳性情况有差异

东城区疾病预防控制中心VCT、东城区拘留所、东城区看守所、医疗机构等筛查实验室样本确证阳性率分别为84.37%、91.43%、92.85%、52.40%，差异有显著统计学意义，χ2=32.904，P<0.01，见表1。

2.3 送检样本的人群分布情况

268份确证样本中，男性215份，女性 53份，男女比例为4.07∶1；其中男性阳性样本162份(75.34%)，女性阳性样本8份(15.09%)(表2)。送检样本中，年龄主要集中在21～40岁，占58.21% (156/268)，该年龄段阳性率77.56%。阳性者中年龄最小的17岁，年龄最大的82岁，不同年龄段人群确证阳性率差异有显著统计学意义(P<0.01)，且年龄主要集中在20～40岁(表2)。

表1 不同送检单位来源的样本确证结果

表2 不同人群样本确证阳性结果的分布情况(n=268)

2.4 WB确证实验的带型分析

170 份确证阳性样品的WB条带中，以全条带(p17、 p24、p31、gp41、p51、p55、p66、gp120和gp160共9个条带全部出现 )和次全带(出现条带≥6个)为主(占94.71%，161/170)。不同条带中，gp160、p66阳性率最高(均为100%)，gp41阳性率最低(82.94%)(表3)。不确定的样本共47份(占17.54%)，条带阳性率从高到低依次为p24(65.96%)、gp160(21.28%)、p17(17.02%)、p66(17.02%)、gp120(10.64%) 、p31(8.51%)、p55(8.51%)、p51(6.38%)、gp41(0.00%)。结果表明HIV-1抗体阳性者 WB 带型以全条带和次全条带为主，其中 gp160和p66无缺失，其余均有不同程度缺失，gp41 缺失率最高(表3)。

2.5 WB实验不确定结果的带型分布

HIV抗体WB实验不确定结果有17种带型，不确定构成比在前3位的带型为：p24占38.29%(18/47)，p17占19.14%(9/47)，p17p24占8.51%(4/47)(表4，图1)。

表3 HIV-1确证阳性样本的WB条带阳性率(n=268)

2.6 不同性别和不同年龄组确证阳性的带型分布

170份阳性样本中，男性162份，女性8份，HIV-1抗体阳性WB实验分布带型在不同性别间差异无统计学意义(P>0.05)，在不同年龄组人群间差异也无统计学意义(P>0.05)，见表5和表6。

2.7 筛查结果与确证结果的相关性

送检的268份血标本都至少有一种试剂筛查有反应，其中一种试剂有反应的有65份，占筛查有反应总数的24.25%(65/268)，两种试剂筛查有反应的有203份，占筛查有反应总数的75.75%(203/268)。268份血标本中采用化学发光法筛查的样本有134份，采用ELISA筛查的样本有111份，采用胶体硒法筛查的样本有23份。结果显示，所有的HIV-1抗体阳性结果均来自由两种试剂筛查有反应的样本。ELISA 与其他方法的确证结果阳性率有显著统计学差异，P<0.01，见表7。

图1 WB实验不同结果的条带图谱

表4 47份不确定者WB实验带型分布

表5 不同年龄样本确证阳性条带分布(n=170)

表6 不同性别样本确证阳性条带分布(n=170)

表7 不同方法检测结果的确证率

3 讨论

从我国发现第1例艾滋病起，公众对待HIV感染者就普遍存在社会性歧视，不愿与之共同工作、生活。据中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心关于影响艾滋病患者就业的调查显示[4]，就业中歧视发生率达42.1%，高于2009年的《中国艾滋病病毒感染者歧视情况调查报告》中的就业歧视率(35.3%)[5]。由于HIV感染者在国内外受到不同程度的歧视，所以HIV 感染者的确诊对其个人和家庭都有着极其重大的影响，这就要求确证实验室的专业技术人员要严格把控 HIV 的确证实验，不容许发生任何错误。北京市东城区共有3家确证实验室，包括北京协和医院、北京市疾病预防控制中心和本中心确证实验室。本中心确证实验室从2016年建立以来，承担着辖区内除北京协和医院外所有筛查实验室及检测点的艾滋病确证工作，对筛查有反应样本进行确证结果的判定是否准确，将会决定 HIV 感染者及艾滋病患者能否得到及时的抗病毒治疗。本研究对东城区170份确证阳性样本的WB实验带型进行分析，发现HIV-1抗体阳性者带型分布在不同性别和年龄之间，其差异无统计学意义，且 WB 实验带型中全条带型及次全带型占比例较高(占94.71%)，表明 HIV 在这些人体内繁殖活跃，感染性高[6，7]；确证阳性样本带型中除 gp160和p66无缺失外，其余均有不同程度缺失，gp41 缺失率最高，与国内其他地区有关报道的结果有些不同[8，9]。分析原因可能是不同传播途径、不同地域和不同遗传背景造成的差异，也可能是HIV感染期向艾滋病期发展的标志。建议临床结合CD4+T细胞计数，评估患者的免疫状态和疾病阶段，及时开展抗病毒治疗。本研究因资料收集不完善，没能作进一步分析。

env基因编码的包膜蛋白前体 gp160在蛋白酶作用下分解为 gp120和 gp41。gag基因编码核心蛋白(gag蛋白)p55, 经酶解后形成 p17、p24等, p17构成内膜蛋白, p24构成衣壳蛋白。gp160和 p55同为前体蛋白, 两者条带出现率并无明显差异,pol基因编码 Pol蛋白, 包括反转录酶(p66/p51)和整合酶(p31)等。 p66、p51和 p31是由pol基因的mRNA翻译不同位置形成的不同蛋白, 三者在 HIV复制中均发挥不同的作用, 因而条带出现率并无较大差异。本研究的HIV抗体WB实验不确定结果有17种带型，出现次数最多的带型为p24，与以往的报道一致[10]。对本研究47份不确定样本中的6份从2016—2019年进行了不间断的随访，最后确认有3份阳转，3份已予排除，其中不确定带型p24，p17p24和p31gp120gp160各阳转1份。 虽然有报道称pol和gag类条带大多是非特异性反应所致[8]，但本研究中出现了阳转的病例，因此既不能忽视其阳转的可能，也要考虑到可能是早期感染病例。这提示我们在实践中要结合筛查实验结果，必要时增加核酸检测，减少漏检和误诊。对47份WB实验不确定结果的样本进行回顾，发现大部分来自医疗机构，由于主客观各种因素的影响，其中41份失去随访，这表明目前的艾滋病防控工作仍存在一定的隐患和漏洞，加大对不确定样本的随访是艾滋病防控的重要内容。

HIV 抗体检测作为筛查实验的一种方法，适合大批量普查，但其结果存在不同程度的假阴性及假阳性[11]，这就需要 WB 确证实验进行最终判定，但WB实验也存在不确定的结果。本研究分析了北京市东城区268份确证实验结果，发现确证结果为不确定的样本占比较大(为19.61%)。造成不确定结果的主要原因有 HIV 感染早期样本及孕产妇、肿瘤、疫苗接种、自身免疫性疾病及其他反转录病毒感染等引起的非特异性反应[12,13]。东城区筛查实验室上送样本的确证阳性率为 63.43%，HIV 抗体确证结果阳性率因送检单位及人群的不同存在较大差异，其中监管场所(看守所和拘留所)上送标本多来自羁押、吸毒和暗娼人群；VCT上送标本多来自有高危性行为的人群，这些是造成其阳性率较高的原因。医疗机构送检人群多为手术前的常规检测、门诊人群和孕产期人群，人群差异化比较大，且多采用化学发光(四代试剂)和快速(胶体硒)检测，在提高检测敏感度的同时也可能增加了检测结果的假阳性反应。本研究结果提示在相同的检测条件下，样本筛查假阳性反应受人群的特征影响因素较大，筛查检测中应该引起足够的重视。但由于化学发光试验采用抗原抗体联合检测试剂，结果可能存在单独抗原阳性、确证阴性的早期感染情况，因此要高度重视，尽快通知患者及早做核酸检测以排除早期感染的可能。尽管医疗机构送检样本 HIV 抗体确证阳性率相对不高，但由于医疗机构检测数量大，受众广泛，全区通过医疗机构筛查发现的 HIV-1抗体阳性者仍然占较大比例，因此医疗机构筛查依然是发现潜在 HIV 感染者的重要途径之一。因此要在医疗机构中进一步扩大 HIV 抗体检测范围和覆盖面，推广医务人员主动提供 HIV 检测咨询工作以便及时发现更多的 HIV潜在感染者。

本实验表明，化学发光法 、ELISA 与胶体硒法的确证结果阳性率有显著统计学差异(P<0.01)，ELISA初筛的确证阳性率明显高于化学发光法和胶体硒法的初筛。胶体硒法具有操作简便、检测时间短、保存和携带便捷等优势，因此适用于急诊等快速检测。化学发光法是近年来筛查 HIV 抗体的流行方法，因其灵敏度高、操作便利、标本可随时检测、上样自动化、检测时间短等优点，被广泛应用于医疗机构。同时化学发光法又可以检测 HIV-1 p24 抗原，在避免艾滋病的漏检方面起到了一定作用[14]。第四代ELISA 试剂盒作为一种成熟并且发展时间长的检测方法，具有很高的稳定性和特异性，假阳性率低，在艾滋病筛查实验中有着其独特的优势，并且能够满足临床需要，建议大力推广使用。但是由于窗口期的存在，所有检测方法都没有绝对的特异度和敏感度，检测的同时应对患者进行咨询，对有高危行为的人群进行一种以上方法的多次检测，以减少漏检的风险。

本研究对上送至本实验室的268份HIV抗体待确定样本进行分析，人群以男性为主，男女比例为4.07∶1。男性阳性率75.34%，女性15.09%。由于艾滋病主要通过血液、性途径和母婴途径传播，而性传播已经成为我国艾滋病流行的主要传播方式，且男男性行为者占比逐年增加[15]，所以这可能是导致男性阳性率高的原因之一。送检样本中年龄主要集中在20～40岁，多为非本地区人士，与以往报道一致[16]。该人群处于性活跃时期，社会交往广泛，流动性强，并且容易发生高危性行为。其中男男性行为更是由于得不到社会的理解，被歧视和偏见影响，使得该人群导致的HIV感染往往得不到控制，出现跨区域的传播，从而导致阳性率高。因此，应该充分利用各种媒体途径，广泛开展 VCT 宣传服务，加大宣传力度，鼓励更多的人接受艾滋病相关知识的健康教育，使 VCT 在艾滋病防治工作中发挥更大的作用，争取早发现潜在的HIV感染者，做到早发现、早诊断、早治疗，减少二代病例发生，从而有效遏制艾滋病的传播[17,18]。本研究不足之处在于未收集到感染者的传播途径和CD4+T细胞数值的资料，而且只对送检样本进行了分析，样本量不大，不能完全确定是否存在人群、性别等选择偏倚。今后应关注这方面的影响因素，结合不同感染方式、不同病程感染者WB实验条带做进一步的分析，找出可能导致差异的原因，为艾滋病的防治措施提供更有效的依据。