耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的超支化等温扩增PCR检测方法研究

董 剑，席家庄，王 杉，何建春，赵峻英*

（重庆市大足区人民医院，重庆 402360）

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是金黄色葡萄球菌的一个独特菌株，能抵抗所有青霉素及其他β内酰胺酶类抗菌药物。至今MRSA感染几乎遍及全球，成为重要的院内感染病原菌之一[1]。MRSA的早期筛查，对临床治疗和院感防控至关重要。然而，传统病原菌培养鉴定耗时较长、灵敏度有限、操作繁琐，难于实现MRSA的早期检测[2]。因此，急需构建具有高效、灵敏、便捷的MRSA检测方法。本研究以mecA基因为目标基因，构建超支化等温扩增PCR检测方法，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

菌株为随机抽取的我院2015年1月～2019年1月保存的经VITEK2 Compact全自动细菌鉴定仪鉴定的MRSA 83株，甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）62株。

1.2 主要试剂

细菌核酸提取试剂盒、dNTPs 、Champagne Taq DNA polymerase由北京天根生物科技股份有限公司生产、PCR引物由上海捷瑞生物公司合成。

1.3 引物设计

根据GenBank 中发布的mecA耐药基因序列，采用Primer 6.0设计，遵循核酸设计的原则，在保守区设计超支化等温扩增PCR技术发卡结构H1、H2、SH1、SH2，采用Oligo 6.0进行评价。

1.4 核酸提取

按试剂盒说明书操作步骤进行细菌核酸提取

1.5 超支化等温扩增PCR反应体系及条件

采用50 μL的反应体系，模板1～5 μL，H1、H2、SH1、SH2 1M共5 μL，dNTPs 4 μL，Buffer缓冲液5 μL，Taq酶0.25 μL，无菌双蒸水补齐。反应条件：62℃水浴恒温 52 min，80℃5 min10 min。

1.6 超支化等温扩增PCR反应产物

取扩增产物10 μL与2 μL上样缓冲液混合，加入到PAGE电泳孔，

恒流100 mA电泳，在凝胶像分析仪下观察并记录结果。

1.7 统计分析

应用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

（1）在电泳图上含mecA基因的金黄色葡萄球菌（MRSA）被检出，有梯状条带出现，

不含mecA基因的金黄色葡萄球菌（MSSA）不出现条带，呈阴性。

（2）145株金黄色葡萄球菌两种方法的检测结果

145株金黄色葡萄球菌中，VITEK2 Compact全自动细菌鉴定共检出MRSA83株，检出率57.24%，超支化等温扩增PCR在以上83株MRSA中全部找到mecA基因，在62株MSSA中找到3株含mecA基因，MRSA检出率59.31%。两种检测方法结果比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

本研究所构建的超支化等温链扩增PCR技术[3-5]，采用临床分离的菌株进行检测具有较好的特异性，含mecA基因的金黄色葡萄球菌可出现有梯状条带出现，不含mecA基因的金黄色葡萄球菌则呈阴性。对145株金黄色葡萄球菌的检测结果来看[6-8]：超支化等温链扩增PCR技术与VITEK2 Compact全自动细菌鉴定和药敏分析仪，二者对MRSA检出率相比差异无统计学意义[9-11]（P＞0.05）。两种方法结果不一致的3株，符合率97.93%。在本研究超支化等温链扩增PCR反应体系过程中仅需一个普通的恒温水浴箱，不需昂贵的PCR仪。只需1 h左右就可得到检测结果，相较于常规的细菌培养和鉴定流程时间大大缩短[12-14]，可在基层的实验室开展。