人血清趋化因子CXCL8在HBV感染性肝脏疾病中的表达水平及相关性研究

王德麟，汪晓莺

(1 江苏省南通市第三人民医院检验科，南通 226006；2 南通大学医学院免疫学系)

病毒性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的以肝脏病变为主的一种传染病。全球约有20亿人感染HBV，我国HBV感染者约1.3亿，其中慢性乙型肝炎患者3 000万。病毒性肝炎的发病机制比较复杂，至今尚未完全阐明，取决于多种因素，尤其与机体的免疫状态有密切的关系[1-2]。趋化因子是20世纪80年代末引起广泛关注的一大类结构相似、功能相近的小分子蛋白质。国内外学者[3-4]证实，部分趋化因子在病毒性肝脏疾病发生、发展过程中起作用，本研究对人类趋化因子CXCL8在乙型病毒性肝炎、肝硬化发生、发展及诊断中的作用进行探讨。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2015年6月―2016年12月在南通市第三人民医院住院确诊为乙型肝炎病毒感染患者100例，其中男69例，女31例；年龄22～70岁，平均43岁。纳入标准：(1)符合慢性乙型肝炎诊断标准，参照《中国慢性乙型肝炎防治指南(2014年版)》；(2)依从性良好；年龄＞16岁，＜75岁，男女不限。将经临床确诊的乙肝病例分为慢性乙型肝炎、急性乙型肝炎、肝细胞癌和肝硬化组(表1)；正常对照组为排除乙型肝炎病毒感染，两对半、肝功能正常的健康体检者。

表1 各病例组主要生化指标及病毒载量()

注：ALT，alanine aminotransferase，丙氨酸氨基转移酶；AST，aspartate aminotransferase，天门冬氨酸氨基转移酶；PT，prothrombin time，凝血酶原时间；Tbil，total bilirubin，总胆红素。

1.2 实验方法

1.2.1 仪器与试剂 WELLSCAN K3酶标仪(芬兰雷勃公司)，人类趋化因子CXCL8检测试剂盒(美国BD公司，批号201402)。

1.2.2 标本制作 患者入院后次日清晨空腹采集常规静脉血5 mL，室温静置2 h，1 000 r/min离心10 min，分离血清，-20 ℃保存。

1.2.3 检测方法 采用酶联免疫吸附法(双抗体夹心法)检测人类趋化因子的含量。用纯化的人趋化因子抗体包被微孔板，制成固相抗体，在包被单抗的微孔中加入趋化因子抗原，再与辣根过氧化物酶(horse-radish peroxidase,HRP)标记的CXCL8抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)显色。TMB在HRP的催化下生成蓝色化合物，并在终止液的作用下转化成最终的黄色(颜色的深浅和样品中的趋化因子CXCL8呈正相关)。

1.2.4 实验过程 在酶标包被板上按浓度由大到小依次加入各个浓度的标准品、待测样品及对照品，用封板膜封板后置37 ℃温育30 min。用配置好的洗涤液重复5次洗涤后拍干加酶。37 ℃温育30 min后再洗涤，显色15 min终止(此时蓝色转为黄色)：以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(optical density,OD)值，通过标准曲线计算样品中人趋化因子CXCL8的浓度。

1.3 统计学方法 应用Stata 10.1软件进行分析，两样本均数比较采用t检验，相关性采用直线相关和回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

慢性乙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌、急性乙型肝炎组的CXCL8含量分别为(6.45±1.97)、(6.52±1.92)、(7.01±1.86)、(6.44±1.37) μg/L，均高于正常对照组[(4.88±0.67) μg/L](P＜0.01,P＜0.05)；各病例组间差异不明显(P＞0.05)；各病例组HBV-DNA含量与趋化因子浓度之间的相关系数分别为-0.2354、-0.2775、0.0154、-0.0286，无明显相关性(P＞0.05)。

3 讨论

CXCL8又称白细胞介素(interleukin,IL)-8，也被称为中性粒细胞激活蛋白-1，是1986年由德国弗莱堡大学皮肤学实验室[5-6]首先证实，是最早被发现的含有ELF序列的CXC亚家族一员，定位于人第4号染色体(q19～q21)。CXCL8由IL-1、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)、γ 干扰素(interferon,IFN)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等诱导单核/巨噬细胞、成纤维细胞和表皮细胞等多种细胞合成和分泌[7-9]。CXCL8的主要功能是同表达其配体的免疫细胞结合，激活并趋化相应的免疫细胞，参与组织损伤与修复，在机体抗感染抗病毒等多种炎性疾病中发挥重要作用。CXCL8对中性粒细胞、淋巴细胞和嗜碱性粒细胞有很强的趋化作用[10-12]。

乙型肝炎是一种由HBV感染引起的以肝脏局部大量淋巴细胞、单核细胞等炎性细胞浸润的疾病，CXCL8主要通过激活免疫细胞参与乙型肝炎的病程。无论是急性乙型肝炎还是慢性乙型肝炎，在人体感染HBV后，受感染的肝细胞均可迅速识别病毒RNA，分泌IFNα 和IFNβ，并一起激活自然杀伤细胞，且刺激病毒感染的细胞表达主要组织相容性复合物-1类分子，使感染细胞更易于被呈递于T细胞，活化T细胞。活化的细胞毒性T淋巴细胞分泌高水平IFNγ。TNFα、IFNγ 和LPS等物质均可诱导单核/巨噬细胞、成纤维细胞和表皮细胞等多种细胞合成和分泌CXCL8[13-14]。另外，HBV侵入人体后，在肝细胞内复制增殖，产生大量病毒抗原，诱导机体单核/巨噬细胞、成纤维细胞及肝实质细胞分泌趋化CXCL8因子。在慢性病毒性肝炎患者中，多种免疫细胞及某些在正常情况下无趋化因子分泌活性的细胞也可分泌CXCL8[15-16]。

当CXCL8遇到表达CXCL8配体CXCR1/2的特异型免疫细胞时，CXCL8便与之结合，激活G蛋白传导通路，进行信号转导[17-18]，激活基因表达，细胞合成分泌一些参与细胞运动的蛋白质，促进细胞迁移。这样CXCL8便与配体结合，将信号传递给效应细胞，效应细胞向乙肝病毒聚集的部位迁移，发生抗病毒的炎性免疫反应[19-20]。只要人体内存在H-BV病毒，均可刺激机体的特异性免疫细胞产生趋化因子参与抗病毒的免疫反应，可见病毒刺激对CXCL8因子的产生起主要作用，在病毒刺激下肝细胞分泌的各类分子激活人体的免疫系统，完成抗病毒的免疫反应过程。

在病毒性肝炎及其相关疾病中，趋化因子CXCL8参与整个抗病毒反应的过程，并在其中起着重要作用。因此，研究CXCL8参与HBV的反应机制对HBV及其相关疾病的临床诊疗有着重要价值。