红细胞微粒及其生物学性质的研究进展

朱跃跃 卞茂红

微粒（microparticles，M P s）又名微囊泡 （microvesicles）或核外颗粒体（ectosomes），是由不同类型的细胞例如血小板、白细胞、红细胞、内皮细胞、单核细胞甚至肿瘤细胞等释放的一种直径在0.1～1 μm之间的浆膜囊泡[1]。研究表明各种细胞衍生的MPs在大小、磷脂成分、表面抗原和蛋白组成方面有很大不同，但同时也保留了来自亲代细胞蛋白质的子集和以便识别它们起源的表面受体[2]。在健康人体中循环MPs大部分来自血小板和/或巨核细胞[3,4]。MPs的释放是由各种刺激引起的调控过程，包括活化、凋亡、剪切应力、补体攻击或损伤等[5]。在各种病理状态如血栓形成、心血管疾病中，血浆MPs浓度会显著增加。

1 红细胞微粒（red blood cell microparticles, RMPs） 尽管红细胞输注是临床上常用的辅助治疗手段之一，但也存在一定的风险。在过去10年里，越来越多的证据表明，输注储存的红细胞可能引起感染、输血相关性急性肺损伤（TRALI）、多器官功能衰竭和死亡等输血相关副反应。研究提示红细胞的免疫功能会随着储存时间的增加而降低，从而影响临床输血的安全性[6]，其释放的RMPs也与输血不良反应有较高相关性[7]。但也有证据表明输注的红细胞储存时间长短与输血后不良反应没有直接关系[8]。这种争议可能部分是由“短期储存”的定义引起的。有数据表明，大多数红细胞促凝活性的显著变化发生在存储的第5天[9]。而最近的两篇报道，Lacroix等人[10]和Steiner等人[11]对短期储存的定义分别为6天和7天。

1.1 RMPs的来源：RMPs的主要特点与来自其他细胞的MPs有相似之处，但RMPs的大小更均匀，平均直径0.15 μm左右，并常伴有更小的囊泡体，称为纳米囊泡[12]。分析全血分离获取的血液成分，结果表明RMPs约占富含血小板血浆中总MPs的4%～8%[13]。RMPs是在多种病理条件如炎症反应、缺氧等各种刺激因素作用下红细胞激活或者程序性细胞死亡时的产物。RMPs的形成和释放贯穿于红细胞的整个老化过程。目前发现能够诱导红细胞产生RMPs的因素有血流切应力、补体蛋白C5b-9、氧化产物或者程序性细胞死亡前的刺激[5]等。RMPs的具体形成机制尚未阐明，目前比较受认可的RMPs形成模型主要有二种：红细胞程序性死亡模型和带3蛋白聚簇模型。前者将有核细胞对各种应力发生类似细胞凋亡机制应用于红细胞。因为有核细胞凋亡的典型特征如细胞皱缩、膜出泡及磷脂酰丝氨酸暴露同样也在红细胞中发现。具体就是红细胞通过非特异性阳离子通道的Ca2+内流导致细胞内Ca2+活性增加，可进一步激活Ca2+-K+通道，随后K+外流，导致红细胞膜超极化。另外Ca2+可刺激半胱氨酸内肽酶降解红细胞骨架蛋白，以上几种因素可导致红细胞膜出泡释放RMPs[14]。在带3蛋白聚簇模型中，将血红蛋白的氧化和高铁血色原的形成与细胞膜上通过二硫键结合的带3蛋白二聚体相关联，此二聚体诱导了带3蛋白细胞膜外结构域的改变，易被天然的带3抗体识别而清除。虽然未能直接证明带3新抗原导致红细胞产生囊泡，然而从RMPs富含带3和其二聚体可以推测这可能是红细胞排除新抗原的一种方式。以上两种模型都是与红细胞膜磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻和细胞骨架蛋白降解、带3蛋白的磷酸化有关。这一过程会导致细胞膜结构不稳定，从而促进了RMPs的形成和释放[15]。

1.2 RMPs的组成：MPs是由膜和膜内容物构成，膜主要含脂类和蛋白质，具有脂质双分子层，外层是带负电荷的磷脂。膜内容物包含母细胞来源的基质蛋白、转录因子、遗传物质、脂质和细胞器等。其生物学特性一方面取决于它们的循环数量，但更主要的是取决于其成分。RMPs中血红蛋白的含量约为循环红细胞的20%[16]。RMPs的脂质是包含特异蛋白分子的脂质筏形式，其富含糖基醇磷脂（glycosylphosphatidylinositol，GPI）-锚定蛋白，缺乏主要的跨膜蛋白。RMPs的磷脂成分与完整红细胞膜上含有的磷脂类似，但也有不同之处，比如RMPs的磷脂酸含量比红细胞多10倍而磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）含量略低于红细胞[17]。

1.3 RMPs的检测方法：迄今为止，虽然MPs已引起越来越广泛的关注，但仍没有确立标准的MPs计数分析方法。较常用的方法有电子显微镜、蛋白质组学方法、流式细胞术等。其中流式细胞术是目前临床广泛应用的一种检测方法，不仅可以检测 RMPs 的来源，还可以对其进行半定量分析。传统的流式细胞术对于直径＜0.30 μm 的细胞微粒不敏感，所以计数MPs时，往往忽略了直径较小的RMPs。在RMPs浓度很高的样本中，由于RMPs的黏附特性，流式细胞仪不能区分大的RMPs和聚集的RMPs，从而也可能造成RMPs计数偏低[18]。较小的MPs可能会提供一个促凝表面，而事实上已经证明直径小于200 nm的MPs至少占了50%的凝血酶生成能力[19]。微粒计数方面的偏差可能是引起RMPs性质和功能诸多争论的部分原因。

可以通过流式细胞仪检测RMPs表面与红细胞特异表达相同的血型糖蛋白A（CD235a）来验证RMPs的来源。膜联蛋白V（annexin V）可与PS结合从而在流式细胞仪检测MPs[12]，但这种方法可能会产生一些误判，因为被染色的除了MPs外还有细胞碎片。此外，也有研究表明，并不是所有的微粒都表达PS[12]。羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）可以成功地用于识别特定的完整的封闭囊泡膜，用CFSE染料结合抗CD235a抗体可以很好地排除碎片干扰,更灵敏地识别RMPs。Grisendi等人提出了联合CFSE、CD235a和annexin V多参数染色的方法来测定RMPs。数据表明CFSE/ CD235a双标记比annexin V/ CD235a检出的RMPs数量多4～7倍[20]。有报道称乳凝集素（lactadhein）是一种比annexin V更灵敏的PS标记物[21]，但是Aung HH等人证明了二者在结合PS作用上几乎一样[22]。张宁洁等人指出，“二次离心”方法和超滤离心管相结合可显著提高 RMPs 的回收率[23]。灵敏度和特异性更高的MPs检测方法有待进一步研究发现。

2 RMPs的生物学功能 起初人们认为MPs只是没有任何生物功能的细胞碎片或“尘埃”[24]，但随着对MPs的了解越来越深入，它们已经被公认可参与广泛的生物学反应，如炎症、凝血、免疫功能的调节，并能作为细胞间生物活性物质运输及转换的传递介质来进行信息传递。下面介绍几个RMPs可能具有的生物学功能。

2.1 清除物质：红细胞在储存过程中，会发生一系列生化和形态改变，称之为“储存损伤”[25]。通常，这些变化包括ATP和2,3-DPG浓度降低，酸中毒，细胞氧化损伤，细胞膜完整性受损以及可变形性下降等[26]。在输血研究范畴下，RMPs数量的增加也被认为是储存损伤的一种表现形式[27]。在红细胞生命周期内，其通过囊泡排放损失了大约20%的体积，同时血红蛋白浓度增加了14%[28]。有些学者认为囊泡形成是有益的，可帮助衰老红细胞除去其胞内积累的特定有害物质如变性血红蛋白、C5b-9补体攻膜复合物、带3新抗原或免疫球蛋白IgG等[28，29]。但也有学者认为RMPs的生成会促进人体内红细胞的清除。CD47是正常红细胞膜表面的一种蛋白，巨噬细胞能够识别CD47，从而不会吞噬红细胞，RMPs的释放会使红细胞膜表面的CD47表达减少，此时巨噬细胞将启动其吞噬机制而导致体内红细胞减少[30]。

2.2 信息传递：MPs可通过其表面活性分子的作用来激活细胞受体，调节细胞反应及改变其性质。MPs可通过转染mRNA和miRNA到靶细胞来影响其基因的表达，MPs也可以通过直接转移活性物质来调节细胞的功能[31]。RMPs能作为细胞间生物活性物质运输及转换的传递介质，主要包括转移肽、蛋白质、脂质成分、miRNAs、mRNA和DNA[32]。疟原虫感染时，体内RMPs数量增加，此时高浓度的RMPs对于细胞间的通讯起到了至关重要的作用，已有研究证明RMPs 与疟原虫DNA转录和密度调控之间具有紧密的联系[33]。此时RMPs从被感染的红细胞中定量释放，大多数RMPs是在无性生殖周期的晚期释放的，它们含有人源和恶性疟原虫衍生的蛋白质和其他物质。已有证据表明RMPs可在被感染的红细胞之间充当信使。RMPs在感染的红细胞之间转移，改变种群内传播阶段的产生。此研究为系统研究RMPs在疟疾发病机制中的作用以及作为疟原虫生命周期中细胞间通讯的媒介提供了理论依据[33]。

2.3 凝血：RMPs同其他MPs一样，在形成过程中伴随着膜不对称性丧失，从而暴露出带有负电荷的磷脂，尤其是PS[1,14]。 PS促进凝血因子Ⅱ、Ⅶ、IX和X的结合，以及凝血复合物的组装，从而加速凝血酶的形成[16]。 PS外翻暴露为钙离子依赖的凝血酶复合物的对接提供了条件，并为促进凝血酶生成的tenase和/或凝血酶原酶复合物提供了一个催化表面。带负电荷的PS以及钙离子是凝血酶原酶复合物（如tenase）和凝血酶原酶装配所必需的[34]，血小板衍生的MPs（PMPs）已被证明具有比血小板自身高50～100倍的促凝活性[35]。通过体外实验数据估算膜表面单元证明，RMPs膜比血小板膜能更有效地支持凝血酶的形成[36]。而RMPs表面同样具有带负电荷的膜结构，能够在含有少量外源性组织因子存在的情况下增加凝血酶的生成，甚至在没有组织因子时亦可启动、传播凝血酶生成[37]。有证据表明，这种促凝活性依赖于FⅫ[38]，也有人则认为RMPs是通过依赖FⅪ的方式启动内源性凝血途径[39]。Biro等人认为RMPs膜表面表达组织因子（tissue factor，TF），有助于RMPs的促凝作用[40]。最近Jy等人又证实了RMPs通过独立于内源性途径之外的途径促进凝血，说明RMPs上含有TF参与凝血过程[41]。值得注意的是，RMPs数目在某些高凝病理状态如镰状细胞危象时会增加[42]。有趣的是，RMPs还可以结合蛋白C的辅因子蛋白S，进而降低FVa和FⅦa活性，抑制tenase和凝血酶原酶活性，从而导致凝血途径的抑制[43]。

2.4 炎症：有研究表明RMPs通过促进选择素P与其配体的相互作用，以及通过提高C反应蛋白、免疫球蛋白和CD11b的数量，间接诱导中性粒细胞的趋化作用，从而促进炎症反应[44]。Zecher等证明RMPs能够在炎症环境中增强肺泡巨噬细胞、脾脏巨噬细胞释放炎性因子。另外，还验证了RMPs在补体5a受体缺失的小鼠体内无法诱导炎性因子的释放，进一步说明RMPs可通过补体活化经典途径，促进炎性因子的释放[45]。RMPs膜表面还表达Duffy抗原，研究证实这种抗原在炎症反应中起重要作用，主要由趋化因子配体1（CXCL 1）的聚集以及与血小板之间的相互作用引起，刺激血小板释放α糖蛋白颗粒而放大炎症反应[46]。另外，RMPs也可能有抗炎作用。Sadallah等[47]发现RMPs能够持续抑制炎性因子如肿瘤坏死因子-α、白介素-8或白介素-10的释放。RMPs还可以通过调节膜上PS的表达或者其他机制间接抑制巨噬细胞的活性，从而影响炎症的产生过程。总之，目前RMPs对炎症反应是促进还是抑制作用的问题尚未有统一定论，仍须进一步研究。

3 RMP与疾病 RMPs水平在很多疾病如免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig) A肾病、肾病综合征 (nephrotic syndrome，NS)、溶血性疾病等中均上升，其或许可作为诊断疾病的指标之一。

3.1 镰状细胞病：在镰状细胞病中,聚合的异常血红蛋白S影响了红细胞膜的稳定性，导致红细胞形状由圆盘状变为镰刀状。RMPs水平在疾病平稳期及危象时均升高，影响血管内溶血率和凝血激活的程度[42]。由于其血红蛋白含量及暴露的PS，RMPs可以作为一氧化氮（NO）清除率和促凝血活性升高的指标之一。RMPs中含有超过一半的游离血浆血红蛋白，可以显著地影响NO生物利用度[48]。镰状细胞病中RMPs水平可与升高的血管内溶血率、并发症倾向一起用于定义亚临床表型[49]。

3.2 急性移植物抗宿主病：干细胞移植后，发生急性移植物抗宿主病的患者RMPs水平升高。因此，RMPs可能作为区分急性移植物抗宿主与感染或脓毒症等并发症的诊断指标之一。在急性移植物抗宿主病伴随微血管病变患者中观察到大量的RMPs，表明红细胞的机械性破坏对RMPs释放起到一定作用[50]。

3.3 输血后急性肺损伤（transfusion-related acute lung injury, TRALI）：TRALI是一种具有较高死亡率的输血相关不良反应，其最有说服力的发病机制是“二次打击”模型。“第一次打击”是外伤、感染等使中性粒细胞等产生炎性反应，此后输入含有各种细胞因子、抗体及生物活性脂质的血液制品使已经致敏的中性粒细胞发生一系列反应从而诱发TRALI为“第二次打击”[51，52]。最近的研究提出RMPs中富含的IgG与补体通过Fc受体活化中性粒细胞或者RMPs直接结合并活化中性粒细胞，从而导致TRALI的发生[53]。另外RMPs具有很强的促凝血活性致使输血后肺微血管血栓形成，导致缺血性肺损伤。

4 结语 由于目前检测技术和实验研究方法的限制，RMPs的表型和功能尚未完全明确。RMPs在疾病中的相互作用尚不明确，它们既可表现为协同作用，也可表现为拮抗作用，甚至同一种MPs可同时表现出相互矛盾的生物学功能。深入研究RMPs有助于明确输注储存的血液制品对受血者的影响，对临床输血的安全性及有效性具有重要的意义。RMPs有望作为一种新兴的生物标志物，为包括血栓性疾病在内的多种疾病的诊断和治疗提供新的思路和途径。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突