不宁腿综合征/Willis-Ekbom病的原发性震颤易感基因的相关性研究

赖小梅，李 根，陈 捷，黄豫萌，马建芳

1 资料与方法

1.1 资料 研究人群：RLS/WED是由2位RLS/WED专家根据2014年国际RLS/WED研究组(IRLSSG)诊断标准的修订版进行诊断的[2]。我们入组了原发性RLS/WED，排除了继发性RLS/WED，包括继发于帕金森病、肾功能不全、缺铁、糖尿病和周围神经病等。对照组样本招募了社区健康人群，并由RLS/WED专家进行了评估，以排除RLS/WED和原发性震颤。我们对每位入组的患者和健康人群都进行了铁蛋白的检测，铁蛋白水平降低的患者也被排除在外。IRLSSG评分量表用于评估RLS/WED的严重程度[16]。该研究得到上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会的批准。此外，所有RLS/WED的治疗病史由上海交通大学附属瑞金医院提供。所有参与者均签署知情同意书。

1.2 方法 DNA制备和基因分型：我们从每个参与者收集约2 ml血液样品，采用苯酚-氯仿-异丙醇法提取DNA[17]。通过聚合物链反应(PCR)扩增的基因片段包含：STK32B的rs10937625，CTNNA3的rs7903491，rs10822974和rs12764057以及PPARGC1A的rs17590046。扩增引物设计来自于国家生物技术信息中心(NCBI)的Primer-BLAST网站(https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/tools/primerblast/index. cgi LINK_LOC=BlastHome)。使用Sequenom MassARRAY系统上的MALDI-TOF质谱进行基因分型。使用MassARRAY系统对以下SNP和突变进行基因分型：(1)SNP位点：SCN4A的rs571210585，HAPLN4的rs781390304，USP46的rs759572548，HTRA2的rs72470545，HS1BP3的rs11680700，DRD3的rs6280rs6280，SLO17603490的rs11280700，FUS的rs387907274和rs751937417；(2)突变位点：KCNS2c. 1137T>A，NOS3c. 46G>A，NOS3c. 164C>T，FUSc. 1129C>T，TENM4c. 158G>C，TENM4c. 1421C>A，TENM4c. 1553G>A，TENM4c. 3053G>A，TENM4c. 3412G>A，TENM4c. 4100C>A，TENM4c. 4324G>A，TENM4c. 4603A>C，TENM4c. 4895G>A，TENM4c. 5287G>A和TENM4c. 7353G>A。测定设计3.1软件用于设计由MassARRAY测试的SNP的引物。这些SNP和突变的引物列于表1中，PCR的反应系统列于表2中。

表1 经测试的SNP和突变的引物

聚合物链反应(PCR)基因单核苷酸多态性Forward Primer反向引物PCR反应条件STK32BCTNNA3CTNNA3CTNNA3PPARGC1Ars10937625rs7903491rs10822974rs12764057rs17590046GTGCCCTTTATCTCCATCCCTAGGTGCTCTGATGTTGGGACCTCTCTAGGTTCTAAGGCCAATACGCAAGCCTGCACAAACAGTTGAGGTGTTGCAGAGCAGCGCTGTCAGCTCTGATTCTATTCTTGGGCTTCTTATGGGGACGGCCTAGATGTTACCGTGGGTGAATGAAACCAATTCCCGGAGCAAGTGGTCACCTGAA95 ℃ 2 min→95 ℃30 s→54 ℃ 30 s→72 ℃1 min→go to step 2for 35 times→72 ℃ 5 min

表2 PCR反应系统

统计分析：使用SAS(9.4 TS1M2版本；SAS Institute Inc. ，Cary，NC)软件包进行统计分析。t检验用于比较RLS/WED患者和非RLS/WED对照之间的年龄差异。卡方检验用于评估RLS/WED与对照之间所有SNP分布的性别、Hardy-Weinberg平衡(HWE)、基因型和等位基因的差异。通过逻辑回归进行风险分析。计算出每个SNP或单倍型的比值比(OR)和95%的置信区间(CI)。同时，我们评估了显性模型，隐性模型和显性模型。通过Cochran-Armitage趋势测试对加性模型进行了测试。通过Haploview软件(4.2版)测试了同一染色体中SNP的连锁不平衡(LD)。Haploview还测试了单倍型以及1，000，000个排列检验。R语言(版本3.3.1)用于通过Bonferroni方法校正p值。功效和样本量计算(版本3.1.2)用于计算遗传功效[18，19]。

功能预测：我们使用以下关键字搜索PubMed，Embase和EBSCO数据库：“(Restless legs syndrome)AND(gene OR polymorphism)”。我们收集了在RLS/WED中发现的所有基因名称。然后，我们使用以下关键字搜索“在线孟德尔遗传在线”(OMIM)数据库：“dopamine*”。我们将这些基因名称识别为多巴胺相关基因。该数据库，用于检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具(STRING)(版本10.5)用于预测新基因与RLS/WED的已知基因和多巴胺相关基因之间的蛋白质-蛋白质相互作用。我们通过注释、可视化和综合发现数据库(DAVID)(v6.8)进行富集分析，评估新基因与RLS/WED的已知基因和多巴胺相关基因之间的可能关联。

2 结 果

这项研究招募了130例RLS/WED患者和300例健康对照。9例RLS/WED患者因低铁蛋白被排除在外。共有121个RLS/WED，最后招募了300个对照。RLS/WED患者与对照组之间在年龄和性别上无统计学差异。家族性29例RLS/WED患者(23.97%)，女性63例RLS/WED患者(56.76%)(见表3)。

表3 病例和对照的人口统计表1病例和对照的人口统计信息

在SNP的相关研究中，年龄和性别匹配后在显性或显性模型中我们发现2个CTNNA3的SNP与RLS/WED有关联的趋势(rs10822974：OR=0.61，P=0.043，显性模型；rs12764057：OR=1.76，P=0.020，显性模型；OR=0.54，P=0.008，显性模型)，但是Bonferroni方法校正P值后无显著差异(见表4)。此外，我们也没有发现CTNNA3中的单倍型与RLS/WED相关联(见表5)。

表4 候选基因的SNP关联以及比值比与RLS/WED风险

GeneSNPGenetic PowerRecessive Model (adjusted)bPOR95%CIOverdominant model (adjusted)bPOR95%CINumber of sample testedCaseControlCTNNA3DRD3LINGO1PPARGC1ASTK32BSLC1A2USP46rs7903491rs10822974rs12764057rs6280rs9652490rs11856808rs17590046rs10937625rs759572548rs37940870.0540.080.1340.1130.0660.1020.1280.1180.050.050.6910.3950.5720.60.0870.8520.9640.944-0.9440.891.251.250.885.870.94---0.960.49～1.620.75～2.100.57～2.730.55～1.410.77～44.690.48～1.85---0.33～2.780.8930.0430.0080.7550.2850.6720.1110.595-0.8241.030.610.541.080.770.90.620.86-1.130.65～1.640.38～0.990.34～0.850.67～1.740.47～1.250.57～1.440.34～1.180.50～1.49-0.40～3.20107114120115114117109118119112295280296294296298299290300280

在相关基因突变的研究中，我们发1例RLS/WED患者为TENM4的p.R1632H杂合子携带者，但该患者没有出现临床ET的症状，存在慢性持续性RLS/WED症状，家族史阳性。在对照组中未发现TENM4的p.R1632H。我们在对照组和RLS/WED组中均未发现其他的突变位点。

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使用先前给出的搜索方法，将336个基因用于以下生物信息学研究(见表6)。我们没有发现使用DAVID和STRING工具在CTNNA3或TENM4与已知RLS/WED基因与多巴胺能途径之间的已知相互作用。

表6 搜索了336个基因，可用于以下生物信息学研究

3 讨 论

据我们所知，这是首次讨论RLS/WED中原发性震颤的遗传标志物的研究。我们的研究发现CTNNA3的rs10822974和rs12764057可能与RLS/WED超显性模型相关。由CTNNA3编码的蛋白质属于vinculin/α-catenin家族。CTNNA3可以通过免疫共沉淀分析直接结合β-catenin[20]。Wnt/β-catenin信号传导的剂量可影响中脑多巴胺能神经元的神经发生[21]。Wnt/β-catenin信号传导还可诱导小鼠脊髓和后脑底板中的神经发生[22]。此外，CTNNA3还与免疫状态异常有关，例如小儿食物过敏和哮喘[23～25]。免疫学异常可以在RLS/WED患者中并不少见。IL1A和IL1B基因的多态性与RLS/WED相关[26]。某些自免性疾病患者群体中RLS/WED患病率较高，如类风湿性关节炎，银屑病和多发性硬化症等自身免疫性疾病[27～29]。

TENM4与原发性震颤有关。使用少突胶质前体细胞和斑马鱼，TENM4突变的发病机制被认为与轴突导向和中央髓鞘形成的调节有关[14]。在小鼠中，TENM4的功能是诱导中胚层，后者在脊索中进化[30]。此外，TENM4可能会影响运动神经元生长锥的引导[31]。

我们的研究存在一些局限性。首先，中国RLS/WED的患病率相对较低，因此能够招募的RLS/WED患者的数量很少。为了进一步证实我们在亚洲人群中的发现，需要增加样本量进行验证。RLS/WED中亚洲人和高加索人之间的遗传背景不同[32]。所以，也希望也在高加索地区进行类似的研究进一步验证两者之间的关系。其次，我们的研究并未检测到所有与震颤相关的必需基因突变或危险SNP，例如SCN11A[33]。

我们的结果表明，CTNNA3和TENM4可能与中国南方人群的RLS/WED相关。希望将来有更多的亚洲人群RLS/WED队列，继续探索RLS/WED的致病基因。

缩略语

6-OHDA，6-羟基多巴胺

BLAST，基本局部比对搜索工具

CI，置信区间

DAVID，用于批注，可视化和集成发现的数据库

DNA，脱氧核糖核酸

HWE，Hardy-Weinberg平衡

IRLSSG，国际RLS/WED研究小组

LD，连锁不平衡

MPTP，N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶

NCBI，国家生物技术信息中心

OMIM，人类在线孟德尔遗传

或，优势比

PCR，聚合物链反应

RLS/WED，腿动综合征/Willis-Ekbom病

SAS，统计分析系统

SNP，单核苷酸多态性

STRING，用于检索相互作用的基因/蛋白质的搜索工具