miR-146a基因多态性与帕金森病的相关性分析

赵 杰，余巧燕，王润青

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种临床常见神经系统变性疾病，好发于老年人，多以脑黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元的变性死亡为主要病理改变，严重影响老年人生活质量并给社会带来严重经济负担[1～3]。PD具体病因尚不明确，目前认为其可能与环境因素、遗传因素、氧化应激、年龄老化及神经炎症等有关[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)在进化过程中高度保守，可通过影响转录进程调节其靶基因表达。miR-146a在炎症信号通路中起重要作用，研究报道其在癫痫、阿尔兹海默症、PD、缺血性脑卒中等疾病中发挥重要作用[5～8]，但关于miR-146a单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与PD的关系尚鲜有研究。因此本研究拟探究miR-146a rs2910146、rs5709329位点与PD的相关性，以期从基因层面探究其发病机制及临床意义。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用病例对照研究，选取2015年10月-2019年8月本院连续就诊和住院治疗的原发性PD患者446例(PD组)，其中男性214例，女性232例，平均年龄(62.94±8.65)岁，平均身体质量指数(body mass index，BMI)为(24.17±2.18)kg/m2，平均受教育年限为(9.36±3.54) y，首发肢体左侧者211例，右侧者235例。按照中文版蒙特利尔认知评估量表(Montreal Cognitive Assessment，MoCA)将PD患者分为认知正常组(≥26分，n=237)和障碍组(<26分，n=209)；根据运动障碍分为姿势步态障碍型(n=206)、震颤型(n=178)和中间型(n=62)3个亚型。另匹配同期健康体检中心健康体检者450例为对照组，其中男性243例，女性207例，平均年龄(62.17±8.92)岁，平均BMI为(23.96±2.25)kg/m2，平均受教育年限为(9.48±3.27) y。收集所有受试者临床资料，本研究经过本院道德伦理委员会批准通过，所有样品采集及资料调查均取得患者及其家属知情同意并签字确认，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 纳入与排除标准 PD患者纳入标准：(1)符合中华医学会神经学会PD及运动障碍学组制定的关于原发性PD诊断标准[9]；(2)年龄30岁～85岁；(3)均为汉族无血缘关系的本地常住居民。对照组纳入标准：(1)无神经相关疾病及家族史者；(2)年龄30岁～89岁；(3)汉族，无血缘关系。

排除标准：(1)合并脑血管疾病、阿尔兹海默症病史及其他精神疾病者；(2)有服用抗精神病药物史者；(3)有PD家族病史者；(4)临床资料不完整者。

1.3 样本采集及miR-146a基因型检测 采取所有受试者清晨空腹肘正中静脉血4 ml置于-80 ℃保存待检。采用全基因组DNA提取试剂盒(货号：158422，英国QIAGEN公司)提取所有受试者血液DNA，置于-20 ℃冰箱保存备用。miR-146a rs2910146位点上游引物序列(5′→3′)：AACTGAATTCCATGGGTTG，下游引物序列(5′→3′)：CACGATGACAGAGATATCCC；rs5709329位点上游引物序列(5′→3′)：CGGGGCTGCGGAGAGTCTAG，下游引物序列(5′→3′)：GGACCCTCTTGCACACGTGTC。反应体系(25 L)：10×PCR Buffer 5.0 L，上下游引物(10 mol/L)各1 L，dNTP 4.0 L，DNA(10 mol/L)10 L，Taq DNA 聚合酶 0.25 L，ddH2O 3.75 L。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，64 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物置于4 ℃保存。采用DNA纯化回收试剂盒(货号：DP214-3，北京天根生化科技有限公司)纯化回收后送上海生工生物工程股份有限公司进行基因测序。

2 结 果

2.1 PD组与对照组基线资料比较 PD组与对照组性别、年龄、BMI、文化程度比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性(见表1)。

表1 PD组及对照组基线资料比较

2.2 PD组与对照组miR-146a rs2910146、rs5709329位点等位基因频率、基因型分布 PD组与对照组miR-146a rs2910146、rs5709329位点基因型分布均符合哈代-温伯格(Hardy-Weinberg)平衡定律(χ2=4.617、1.047、0.835、1.405，P>0.05)，具有群体代表性。与对照组比较，PD组rs2910146位点G等位基因、GG基因型频率显著降低(P<0.05)。PD组与对照组rs5709329位点等位基因频率、基因型分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 miR-146a rs2910146、rs5709329位点等位基因频率、基因型分布[n(%)]

续表2

2.3 miR-146a rs2910146位点SNP与PD患者认知功能障碍的关系 与正常组比较，认知功能障碍组PD患者miR-146a rs2910146位点G等位基因、GG基因型频率显著降低(P<0.05)(见表3)。

表3 认知功能障碍组与正常组PD患者miR-146a rs2910146位点等位基因频率、基因型分布比较[n(%)]

2.4 miR-146a rs2910146位点SNP与PD临床参数的关系 miR-146a rs2910146位点SNP分布与PD患者年龄有关(P<0.05)，与性别、PD亚型、首发肢体无关(P>0.05)(见表4)。

表4 miR-146a rs2910146位点SNP与PD临床参数的关系 [n(%)]

2.5 Logistic回归分析影响PD发生的危险因素 采用Logistic回归分析校正年龄后，结果发现携带GG基因型是PD发生的独立保护因素(P<0.05)(见表5)。

表5 Logistic回归分析影响PD发生的危险因素

3 讨 论

PD在65岁以上人群中发病率约2%，随着中国社会老龄化人口加剧，PD发病率和致残率呈逐年上升趋势，给患者家庭及社会带来沉重经济负担。目前普遍认为，PD是由环境及基因共同作用引起的一种运动障碍性疾病[10]。赵西耀等[11]研究报道，自噬相关基因7 rs14016位点TT基因型及T等位基因可增加PD发病风险。王庆广等[12]研究报道，α-突触核蛋白中rs356219、rs356165位点多态性在PD发病中发挥着重要作用。近来miRNA与多种疾病发生发展关系备受关注，miR-146a是免疫应答及炎性反应中重要调控因子，可通过Toll样受体(Toll like receptor，TLR)信号通路介导，靶向TLR4、CD40配体(CD40 ligand，CD40L)等发挥炎症调节作用，促进Th1细胞分化等。SNP是一种在人类基因组中密集分布的分子标记，其多样性常用于与疾病关联分析。miR-146a多态性被证实与多种癌症、炎症性疾病等有关[13～15]。其中rs2910146位点及rs5709329位点均是其功能SNP位点，二者均可影响体内成熟miR-146a转录水平[16，17]。程衍杨等[18]研究报道，miR-146a rs5709329位点SNP与儿童癫痫发病有关，rs2910146位点SNP与儿童癫痫易感性无关。尹晓刚等[19]研究报道，miR-146a rs5709329位点SNP与老年癫痫易感性和发作频率无关。但关于miR-146a基因多态性与PD的相关性尚鲜有报道。本研究结果发现，与对照组比较，PD组rs2910146位点G等位基因、GG基因型频率显著降低；PD组与对照组rs5709329位点等位基因频率、基因型分布比较，差异无统计学意义，提示PD组rs2910146位点可能与PD发生有关，rs5709329位点与PD发生无相关性，与文献报道不完全一致，可能与地理位置差异及病例选择异质性等有关。

PD不仅会诱发运动障碍，还可导致患者痴呆、认知功能障碍等。本研究还发现，与正常组比较，认知功能障碍组PD患者miR-146a rs2910146位点G等位基因、GG基因型频率显著降低，另miR-146a rs2910146位点SNP与PD患者年龄有关，与性别、PD亚型、首发肢体无关，PD患者根据发病年龄50岁为界分为早发型和晚发型，然而早发型PD较少见，我国65岁以上人群PD发病率可达2%，可能与年龄老化、多巴胺能神经元变性死亡有关，提示miR-146a rs2910146位点与年龄及PD患者认知功能障碍有关。本研究进一步采用Logistic回归分析校正年龄后，结果发现携带GG基因型是PD发生的独立保护因素，提示miR-146a rs2910146位点可能与PD易感性有关，携带GG基因型可降低PD发生风险。

综上所述，miR-146a rs2910146位点SNP与PD患者年龄、认知障碍有关，携带GG基因型可能降低PD发生风险。但由于本研究样本量少、病例选择范围局限，存在不足，不同种族及不同地域研究对象可能结果不完全一致；另PD发生机制复杂，可能涉及多种基因共同作用，有待后期加大样本量进一步深入探究。