影响西藏卤虫无节幼体在淡水中存活时间的几个因素分析

潘正军 安 然 徐艳婷 肖 新 王 琼 许芳方 杜逸东

(淮阴师范学院生命科学学院, 江苏省特色水产繁育工程实验室, 淮安 223300)

在水产养殖育苗过程中, 卤虫的无节幼体是鱼虾的优质开口饵料[1—3], 随着水产养殖规模不断扩大, 对卤虫资源需求不断增加, 导致卤虫卵的价格不断攀升, 养殖成本也随之上升[4]。虽然现在有干饲料作为开口饵料的开发使用, 但是干饲料适口性差, 且不运动的颗粒对鱼虾苗吸引力低, 不利于对饲料的利用和鱼虾苗的生长发育[5,6], 活饵料仍然是首选; 活饵料供应不足将导致幼鱼虾营养不良,降低生长率以及引起同类相食[4,7]。对于淡水养殖育苗来说, 如果投喂量过大导致短时间内卤虫无节幼体不能被摄取而死亡, 引起水质恶化和成本增加,因此投饵方案开发和了解卤虫无节幼体在淡水中存活时间就很有必要[7,8]。以往的研究多集中于影响卤虫卵孵化率的条件, 极少探讨影响无节幼体在淡水中存活时间的因素[9—11]。

我国西藏盐湖众多, 卤虫资源丰富, 具有很大的开发利用价值[12,13]。对西藏卤虫(Antemia tibetiana)的已有研究涉及生物学特征[14,15]、遗传繁殖[16—18]、营养成分[19]和孵化条件[20—22]等, 但对影响其在淡水中存活时间的因素未见报道, 本文拟选择不同钠盐、孵化盐度、孵化液pH、不同淡水水温等因素, 探讨它们对西藏卤虫无节幼体在淡水中存活时间的影响, 为投饵方案开发、提高卤虫的利用率提供基础性资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

西藏卤虫卵购于天津丰年水产养殖有限公司(西藏大红卵), 真空包装冷冻保藏。

NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaNO3、Na2HPO4、NaOH和HCl(分析纯, 上海国药集团化学试剂有限公司)。

智能人工气候箱(HP1000GS, 武汉瑞华仪器设备有限公司)、电子天平(赛多利斯, BSA224S)、电热恒温水浴锅(HH-8, 上海精科实业有限公司)、精密pH计(PHS-3D, 上海三信仪表厂)、连续变倍体视显微镜(SZ780, 重庆奥特光学仪器有限公司)和电磁振动式空气泵(YT-302C, 森森集团股份有限公司)。

1.2 实验方法

冷冻保存的西藏卤虫卵取适量于4℃解冻24h,放入盛有预先曝气的自来水的烧杯中搅拌, 以沉底的卤虫卵作为实验对象。

为探讨不同钠盐对西藏卤虫卵孵化率及在淡水中存活的影响, 分别用蒸馏水配制15‰的NaCl、Na2CO3、Na2SO4、NaNO3、Na2HPO4和NaH2PO4各250 mL(分别测定各溶液的pH), 置于500 mL的烧杯中, 每个烧杯中数200粒卤虫卵, 在人工气候箱中2000 lx, 28℃充气孵化24h[21,22], 计算孵化率。取孵化出的无节幼体各50只放进盛有200 mL曝气的蒸馏水的烧杯中, 室温下每隔1h计数死亡的无节幼体,并将死亡的无节幼体移出, 观察直至全部无节幼体死亡。以前的研究结果表明15‰ NaCl孵化率最高[21],各组间比较以15‰NaCl组为标准(下同)。

用NaCl配制成8‰、10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰和40‰不同浓度的孵化液, 按上述方法孵化, 取刚孵化的无节幼体各50只在室温下统计其在淡水中的存活时间, 研究不同孵化盐度对西藏卤虫在淡水中存活时间的影响。

配制NaCl为15‰的250 mL溶液8杯, 再利用0.1 mol/L的HCl及0.1 mol/L的NaOH母液分别调整各杯溶液的pH至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0, 每个烧杯中放200粒卤虫卵按前述条件进行孵化, 观察孵化后的无节幼体在淡水中的存活情况, 以探讨不同pH孵化液对西藏卤虫在淡水中存活时间的影响。

为分析不同水温对西藏卤虫在淡水中存活时间的影响, 将在15‰NaCl中孵化的卤虫无节幼体各50只放进装有250 mL曝气清水的500 mL烧杯中,置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃和30℃的人工气候箱中, 每隔1h计数存活的无节幼体, 并将死亡的无节幼体移出, 观察直至全部无节幼体死亡。

除分析不同水温对西藏卤虫在淡水中存活时间的影响外, 其他实验均在室温下进行。所有实验重复3次, 并计算不同条件下各组无节幼体50%和100%的死亡时间。

1.3 数据处理

实验结果用SPSS 16.0进行单因素方差分析, 对各因素进行独立性t检验, 数据以平均数±标准差(Mean±SD)表示,P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同钠盐对西藏卤虫孵化率及在淡水中存活时间的影响

从表 1可以看出, 在Na2SO4溶液中西藏卤虫卵孵化率最高, 与NaCl孵化液相比达显著水平(P<0.05); 在Na2CO3溶液中孵化率最低, 与NaCl孵化液的孵化率相比差异极显著(P<0.01); 其他3组与之相比差异不显著(P>0.05)。在NaH2PO4溶液中孵化的幼虫能脱离卵壳, 但是附肢发育不全, 完全不能展开, 且一动不动, 无法进行后续实验, 所以下面的存活率实验只有5组。

表 1 西藏卤虫卵在不同钠盐条件下的孵化率Tab. 1 Hatching rates of Artemia in Tibet in different sodium salts

从表 2和表 3可以看出, 以NaCl组孵化出的无节幼体在淡水中存活时间最长, 50%存活时间达到13.32h, Na2SO4组孵化的无节幼体显著低于NaCl中孵出的无节幼体存活时间 (P<0.05), 而以Na2CO3和NaNO3为孵化介质的无节幼体存活时间极显著低于NaCl组 (P<0.01), 在Na2CO3中孵化的无节幼体死亡速度最快。同时可以发现, 孵化率最高的Na2SO4组存活时间并不是最长, 显示孵化率高低与存活时间并无相关性。

2.2 不同NaCl浓度对西藏卤虫无节幼体在淡水中存活时间的影响

从表 4可以看出, 孵化液NaCl浓度不仅影响西藏卤虫的孵化率[20,21], 对孵出的无节幼体在淡水中的存活时间也有重要影响, 随着孵化NaCl浓度的增高, 无节幼体在淡水中的存活时间逐渐延长, 至35‰时达到最高, 但当孵化NaCl浓度达40‰时, 存活时间开始下降。从表 5可以看出8‰ NaCl孵化的无节幼体死亡最快, 50% 和100%死亡时间分别只要4.30h和12.00h, 与15‰ NaCl相比均显著降低(P<0.001), 随着NaCl浓度增高此二项时间逐渐增加, 至25‰ NaCl时显著高于15‰组 (P<0.05)。以上结果说明较高的NaCl浓度孵化有利于西藏卤虫无节幼体在淡水中存活较长时间。

2.3 孵化液pH对西藏卤虫无节幼体在淡水中存活时间的影响

已有的资料表明孵化液pH影响卤虫的孵化率[22,23], 从表 6可以看出, 孵化液pH对无节幼体在淡水中的存活时间有明显影响, 随着孵化液pH从6.5—8.0逐渐升高, 存活时间逐渐延长, 至pH8.0时达到最高, 随着孵化液pH继续升高, 存活时间逐渐缩短, 到pH10.0时, 死亡速度最快。从表 7可以看出, 与pH8.0时相比, pH6.5、7.0和7.5 组存活时间都显著低于pH8.0组; pH=8.0组显著高于pH=9.0、9.5和10.0组存活时间(P<0.05), pH=10.0组50%存活时间已不到4h, 说明孵化液pH显著影响西藏卤虫无节幼体在淡水中的存活时间。

2.4 水温对西藏卤虫无节幼体在淡水中存活时间的影响

从表 8可以看出, 在5℃的淡水中, 卤虫生存时间最长, 相同时间内存活率最高, 说明低温更适合卤虫的存活; 随着水温的逐渐升高, 卤虫的存活时间变短, 存活率随之下降。从表 9可以发现, 当水温≥20℃时, 无节幼体死亡速度明显加快, 与水温15℃实验组达到50%死亡率所需15.38h相比, 均差异显著, 且所需时间越来越短, 到30℃实验组时已不足2h。水温低于15℃实验组也显示出随温度升高死亡率提高和死亡速度加快的趋势, 100%死亡时间显著长于15℃实验组。实验结果表明, 水温显著影响西藏卤虫无节幼体在淡水中存活的时间, 较低的水温更有利于卤虫的存活。

表 2 不同钠盐孵出的无节幼体在淡水中的存活时间(以存活率计%)Tab. 2 Survival time of Artemia nauplii in freshwater hatched under different sodium salts (in terms of survival rate %)

表 3 不同钠盐孵出的无节幼体在淡水中50%和100%死亡时间(h)Tab. 3 Nauplii mortality of 50% and 100% of Artemia in Tibet in freshwater hatched under different sodium salts (h)

表 4 不同NaCl浓度孵化的西藏卤虫无节幼体在淡水中的存活时间(以存活率计%)Tab. 4 Survival time of Artemia in Tibet nauplii in freshwater hatched at different salinities (in terms of survival rate %)

3 讨论

卤虫俗称“盐虫子”, 其发育、生长、繁殖均在含盐分的水体中完成, 在长期进化过程中形成了广泛的适应性和对不同盐度的耐受性[11,24—26], 进入淡水后为维持正常的生理活动将耗费大量的能量调节渗透压平衡, 必将影响其在淡水中的存活时间。在淡水养殖实践中, 卤虫无节幼体作为饵料都是直接投喂于淡水中, 其投放量直接影响到苗种生长和存活率[27,28], 投喂量不足将降低生长率甚至引起同类相食[7], 投喂量过大则不仅导致成本上升也易造成水质恶化, 制定合理的投喂方案和确定投喂量使了解卤虫无节幼体在淡水中的存活时间成为必不可少[4, 5, 29]。

影响卤虫孵化率的因素主要有温度[10,21,30]、盐度[11,25]、pH[26,31]和光照[9,32—34]等, 那么影响卤虫无节幼体在淡水中存活时间的因素有哪些？影响程度如何？本文选取孵化钠盐的种类、盐度、孵化液pH及淡水水温进行了探讨。

3.1 不同钠盐

一般生产上孵化液都是用食盐(NaCl)或海水晶配制, 极少考虑不同盐类对孵化率的影响。但是西藏盐湖类型众多, 主要有碳酸盐、硫酸盐、氯化物等不同类型, 不同的盐湖水化学类型具有不同的专属性, 具有南北分带、东西分区的特点[12,35,36]。不同盐湖中出产的卤虫可能已经对不同盐类产生了适应性, 本次的实验结果也证实不同钠盐对孵化率产生显著影响。在Na2SO4溶液中孵化率最高、Na2CO3中最低, 与NaCl实验组相比均差异显著, 这是否说明此批次西藏卤虫卵产地为硫酸盐型湖泊？因购买的是商品卵, 产地不明, 如需了解盐湖类型对孵化率的影响, 尚需进一步研究。不同钠盐种类影响西藏卤虫孵化率不仅与孵化液离子成分有关, 也与孵化液的pH高低有关, 至于NaH2PO4组孵出的幼虫成堆聚集且不运动, 估计是受孵化液pH的影响, 因为NaH2PO4溶液显酸性, 这在后续关于孵化液pH部分讨论。

表 5 不同NaCl浓度孵出的无节幼体在淡水中50%和100%死亡时间(h)Tab. 5 Nauplii mortality of 50% and 100% of Artemia in Tibet in freshwater hatched at different salinities (h)

表 6 不同pH孵化的西藏卤虫无节幼体在淡水中的存活时间(以存活率计%)Tab. 6 Survival time of Artemia in Tibet nauplii in freshwater hatched in different pH incubations (in terms of survival rate %)

表 7 不同pH孵化的西藏卤虫无节幼体在淡水中50%和100%死亡时间Tab. 7 Nauplii mortality of 50% and 100% of Artemia in Tibet in freshwater hatched in different pH incubations

在淡水中的存活时间以NaCl实验组最长, 考察50%存活率的时长, NaCl组>Na2SO4组> Na2HPO4组>NaNO3组>Na2CO3组, 说明孵化率高的实验组存活率不一定高, 存活时间也不一定长, 二者之间并无关联性。与NaCl组相比, 除Na2SO4组外, 均差异显著, 说明不同钠盐不仅对孵化率有影响, 对在淡水中存活时间也有影响, 这种影响可能与进化适应有关, 也可能与在孵化时渗透调节耗能多少有关,因为尽管孵化液质量分数相同, 但各组的离子浓度与pH不同, 造成各实验组胚胎孵化过程中耗能不同, 具体机制如何还需进一步研究[37]。

3.2 NaCl浓度

盐度不仅影响卤虫的孵化率, 还对卤虫形态、生存、生长发育、成熟、生殖和寿命产生显著影响[11,25,31]。不同NaCl浓度孵化的无节幼体在淡水中存活时间呈现随盐度逐渐升高而延长的趋势, 到达一个顶峰后缩短(8‰组最低, 35‰组最高), 说明较高的孵化盐度有利于无节幼体在淡水中的存活。原因在于较低的NaCl浓度孵化时胚胎消耗较多的能量用于渗透压调节, 在不投饵状态下进入淡水会继续消耗大量能量而快速死亡; 随着NaCl浓度的升高逐渐接近于正常生活的水体, 孵化时耗能减少, 用于淡水水体渗透调节的能量相对较多, 存活时间延长[8,11]。但是孵化NaCl浓度过高也将引起胚胎发育耗能增高, 减少进入淡水时的能量储备[11]。以前的研究表明在15‰NaCl浓度时西藏卤虫孵化率最高[21], 本次实验发现该NaCl浓度下的50%存活时间达11h, 完全满足其作为饵料被摄食的时间需求, 从生产成本与效益角度, 实践中选择15‰NaCl浓度孵化是合适的。

表 8 西藏卤虫无节幼体在不同水温淡水中的存活时间(以存活率计%)Tab. 8 Nauplii survival time of Artemia in Tibet in different temperatures of freshwater (in terms of survival rate %)

表 9 西藏卤虫无节幼体在不同水温淡水中50%和100%死亡时间Tab. 9 Nauplii mortality of 50% and 100% of Artemia in Tibet in different temperatures of freshwater

3.3 孵化液pH

西藏盐湖pH在8.11—9.14, 为弱碱性水体[36], 因此西藏卤虫适于在弱碱性条件下孵化, 以前的研究也证实了这一点[22], 体现了西藏卤虫生存和进化的适应。孵化液pH较低将导致卤虫卵进入休眠, 而碱性条件可以激活卤虫胚胎正常代谢并终止暂停的发育程序[37], 0.1mol/L NaH2PO4的pH约4.5—4.7, 这就解释了钠盐实验时该组孵出的幼体附肢发育不全, 不能展开且不动的原因。NaCl、NaNO3和Na2SO4孵化液的pH接近中性, 但是Na2SO4组孵化率显著高于NaCl和NaNO3组, 说明影响孵化率的因素是阴离子的种类[38,39]。Na2HPO4组孵化液的pH=9.51,呈碱性, 孵化率与NaCl组接近, 说明碱性孵化液有利于西藏卤虫的孵化; 但是Na2CO3组的pH达到11.44, 已呈强碱性, 孵化率显著降低, 这是因为孵化液pH影响孵化率与酶的活性有关, 如在pH 8—9孵化酶的活性最强[37]。

在淡水中, 无节幼体的存活时间随孵化液pH升高而延长, pH8.0时间最长, 随后开始缩短, 与各组相比均差异显著。该趋势及最长存活时间均与孵化率结果一致, 可能与机体代谢的酶活性有关, 也与孵化时渗透压调节有关, 较低或较高的pH均会增加维持正常膜电位耗能, 减少在淡水中生活的能量储备, 加快在淡水中死亡速度[11,37]。这一点在不同钠盐影响的实验中也得到证实, Na2CO3组孵化的无节幼体在淡水中死亡速度最快, 是因为在5组孵化液中其pH最高, 孵化过程中能量消耗过多, 严重降低无节幼体在淡水中的存活时间。

3.4 水温

淡水水温显著影响西藏卤虫无节幼体的存活时间, 温度从低到高, 存活时间越来越短, 且死亡速度有越来越快的趋势。本次试验发现5℃淡水中50%死亡时间约需20h, 与15℃组相比差异显著, 当水温≥20℃时, 所有组别的存活时间与水温15℃组差异显著, 到30℃组50%死亡时间已不足2h, 说明温度对无节幼体在淡水中存活时间的影响要强于上述其他因素。水温从低到高会使水生动物卵黄消耗随温度升高而加快[40], 运动加强和游泳速度增加[41], 新陈代谢增强[10], 体内能量消耗增多, 这样,在不投饵状态下卤虫无节幼体随水温升高而死亡速度加快也就不难理解。建议在水温较高的季节育苗时, 应减少每次投喂量而增加每天的投喂次数以减少浪费, 加大育苗池水质监测力度及换水频率,降低苗种死亡风险。

本次实验均在不投饵状态下完成, 与生产实践中方法相同, 可以为鱼虾育苗时西藏卤虫无节幼体使用提供参考资料。