微生物菌剂对植烟土壤酚酸含量和微生物数量的调节作用

钟 宇，曹敬东，郑元仙，王继明，许银莲，童文杰，蔺忠龙，杨 敏，魏 薇，黄飞燕，刘佳妮，闫 鼎，蔡宪杰，陈小龙，余 磊*，何元胜*

(1. 昆明学院农学与生命科学学院/云南省都市特色农业工程技术研究中心，云南 昆明 650214；2.云南省烟草公司临沧市公司，云南 临沧 677000；3.云南省烟草农业科学研究院，云南 昆明 650201；4.中国烟草总公司云南省公司，云南 昆明 650011；5.上海烟草集团有限责任公司，上海 200082；6.河南中烟工业有限责任公司原料采购中心，河南 郑州 450000)

【研究意义】土壤是农作物生长的重要介质，维持土壤良好的微生态环境是保障作物群体生产力的重要前提。烤烟连作障碍是烤烟生产中的一大难题[1]，有必要开发植烟土壤调理及修复的有效方法，提高烟叶产量和质量。【前人研究进展】连作会导致土壤自毒物质积累[2]、营养物质失衡[3]、微生物数量减少[4-5]等问题。土壤微生物能够促进土壤有机质的分解和转化，是维持土壤生态平衡的重要组成部分。研究表明，土壤中的酚酸类物质与土壤微生物活性有着密切的关系[6]，能够显著影响土壤微生物数量和多样性，从而影响土壤养分和植物的生长发育。酚酸对土壤微环境的调控体现在：一方面，酚酸在不影响植株正常生长的低浓度情况下就可以通过直接的自毒作用或间接的抑制或促进作用影响微生物活性[7]，另一方面，不同微生物对酚酸的响应不同，作物持续分泌某些促进病原菌生长的酚酸会改变土壤微生物结构，如黄瓜根系分泌的香豆素对土传病原菌生长有显著促进作用[8]，香草醛能够影响黄瓜根际镰刀菌群落结构[9]，这也是连作作物土传病害逐年严重的主要原因之一。 微生物菌剂是现代微生物发酵技术制备而成的活菌制剂，具有增加土壤肥力、改善土壤微生物结构的作用[10]。Yang等报道微生物菌剂能够改变烟草根际土壤微生物功能多样性，从而改善植烟土壤微环境，减轻土传病害[11]。谭兆赞等施用复合微生物菌剂提高了土壤微生物多样性指数，有效缓解了番茄青枯病[12]。施用微生物菌剂能增加根际土壤有益细菌和真菌，减少土传病原菌，从而有效减轻芦蒿、黄瓜等作物土传病害[13-14]。王佳佳等研究微生物菌剂对土壤化感物质的响应，结果表明，微生物菌剂能够显著降低土壤酚酸积累量，改善土壤理化性质[15]。【本研究切入点】近年来对微生物菌剂的研究多集中于改善土壤理化性质或改善土壤微生物多样性方面，微生物菌剂对植烟土壤的修复作用，以及在微生物菌剂处理下土壤酚酸类物质与微生物数量的变化及二者的相关性鲜见报道。【拟解决的关键问题】针对植烟土壤微生态失衡、土传病害严重问题，研究不同微生物菌剂对土壤酚酸含量和微生物数量的调节作用，为利用微生物菌剂修复连作障碍植烟土壤提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烤烟品种为“云烟87”。供试微生物菌剂为双藻菌露200微生物菌剂，由青岛海大生物集团有限公司提供，其功能菌为地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌 (B.subtilis) 和巨大芽孢杆菌 (B.megateriu)，有效活菌数≥200.0亿/g。农用微生物菌剂，由山东领拓农业科技有限公司提供，其功能菌为解淀粉芽孢杆菌 (B.amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌，有效活菌数≥30.0亿/mL。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌 (B.licheniformis) 复合粉剂，由云南省都市特色农业工程技术研究中心提供，有效活菌数≥5.0亿/g。

1.2 试验地概况

试验地位于云南省临沧市耿马县勐撒镇 (99°23′22′′E, 23°33′ 40′′N)，海拔1120 m，土壤类型为红壤，质地为轻粘土。试验地土壤pH值为4.69，有机质含量为29.13 g/kg，水解性氮含量为155.28 mg/kg，有效磷含量为8.84 mg/kg，速效钾含量为145.97 mg/kg。

1.3 试验设计

试验共设3个处理，1个对照。处理T1，施用双藻菌露200微生物菌剂6 kg/hm2；处理T2，施用农用微生物菌剂75 L/hm2；处理T3，施用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌复合粉剂300 kg/hm2；处理4 (CK)，空白对照，同期等量清水灌根。微生物菌剂于作物全生育期内施用1次，用量为400 mL/株，作物移栽当天边灌根边移栽，区组排列随机，每小区种植30株，每个处理重复3次。

1.4 试验方法

1.4.1 土壤样品采集 于打顶7 d后，利用5点取样法采取每个处理烟株根际土壤2 kg，立即置于4 ℃保存，用于酚酸含量和土壤微生物的测定。

1.4.2 根际土壤酚酸类物质测定 土壤酚酸类物质的测定采用高效液相色谱法进行。称取20 g供试土样加入100 mL NaOH (2 mol/L)震荡提取3 h，于4 ℃静置3 h，上清液用乙酸乙酯萃取后45 ℃蒸干，加入5 mL 色谱纯甲醇，过0.22 μm滤膜。滤液用外标法测定酚酸类化合物，混和标准样品为0.1 μg/mL对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸和阿魏酸。

色谱仪为WATERS2695高效液相色谱仪 (美国WATERS公司)，色谱柱为Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm, 美国WATERS公司)，流动相A、B分别为0.3 %乙酸水溶液和甲醇，流速0.3 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μl。洗脱程序：0 min：95 %流动相A，5 %流动相B；1 min：80 %流动相A，20 %流动相B；5 min：70 %流动相A，30 %流动相B；7.5 min：20 %流动相A，80 %流动相B；10 min：95 %流动相A，5 %流动相B。

1.4.3 土壤微生物数量测定 根际土壤细菌、真菌和放线菌种群数量测定采用稀释平板计数法，细菌培养采用牛肉膏蛋白胨培养基 (牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g、琼脂15 g、水 1000 mL、pH 7.0)，真菌培养采用孟加拉红培养基 (葡萄糖1 g、蛋白胨0.5 g、KH2PO4·3H2O 1 g、MgSO4·7H2O 0. 5 g、1 mg/mL孟加拉红3.3 mL、琼脂 15 g、水 1000 mL)，放线菌培养采用高氏一号培养基 (可溶性淀粉20 g、NaCl 0.5 g、KNO31 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂 15 g、水 1000 mL、pH 7.4～7.6)。微生物数量以每克样品的菌数表示，每克样品中菌数=平板上菌落数×稀释倍数。

1.4.4 烟株农艺性状和生物量测定 于打顶后7 d，测定各处理组代表性烟株农艺性状指标及烟株地上部 (茎、叶)、地下部 (根) 鲜重和干重，每个处理3株。

2 结果与分析

2.1 微生物菌剂对根际土壤酚酸类物质含量的影响

图1表明，微生物菌剂的施用能够显著降低对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸5种酚酸类物质在根际土壤中的积累。处理T1较处理T4 (CK)分别降低了59.76 %、19.16 %、59.30 %、66.08 %和74.83 %；处理T2较处理T4 (CK)分别降低了57.00 %、65.00 %、51.00 %、53.00 %和65.00 %；处理T3较处理T4 (CK)分别降低了21.25 %、24.04 %、15.12 %、32.94 %、45.03 %。处理T1和处理T2对阿魏酸的降低效果最为显著，降幅分别为74.83 %和65.00 %。从总体看，处理T2对各类酚酸含量的降低效果最好，降幅达51.00 %～65.00 %。

图1 不同处理根际土壤酚酸类物质含量Fig.1 Soil phenolic acid contents with different treatments

2.2 微生物菌剂对根际土壤微生物数量的影响

利用平板稀释分离计数法测定根际土壤微生物群落组成和数量。从表1可见，微生物菌剂处理下细菌、真菌和放线菌的数量均比对照组多。其中，处理T1的根际土壤细菌、真菌和放线菌数量分别为处理T4 (CK)的175.59 %、208.70 %和258.06 %；处理T2的根际土壤细菌、真菌和放线菌数量分别为处理T4 (CK)的178.19 %、213.04 %和322.58 %；处理T3的根际土壤细菌、真菌和放线菌数量分别为处理T4 (CK)的144.02 %、228.26 %和256.45 %，不同菌剂之间各类群微生物数量差异不明显。

2.3 根际土壤微生物数量与酚酸类物质含量的相关性

根际土壤微生物数量与酚酸类物质含量显示不同程度的负相关性 (表2)，其中，细菌数量与对羟基苯甲酸、4-香豆酸和阿魏酸呈显著负相关(P<0.05)，放线菌数量与香草酸呈极显著负相关(P<0.01)。

2.4 微生物菌剂对烤烟主要农艺性状和生物量的影响

由表3可见，微生物菌剂处理下烟株的株高、有效叶片数、叶长、叶宽、茎粗及生物量等均高于对照组，其中以生物量的影响最为显著，处理T1、处理T2和处理T3单株干重分别为处理T4 (CK)的124.15 %、111.62 %和126.99 %，说明微生物菌剂对烤烟的生长有一定的促进作用。

3 讨 论

酚酸类物质可通过植物自身根系分秘、微生物腐解、淋溶等多种途径进入土壤，并影响土壤微生物结构与活性。研究表明，土壤中的酚酸物质既能抑制有益微生物的生长，也能为病原菌生长提供营养，从而改变土壤微生态平衡，这是连作作物土传病害逐年严重的原因之一[16-17]。微生物菌剂是利用有益微生物菌群经特殊工艺制成的活菌制剂，施用微生物菌剂能调节土壤酚酸含量，促进作物生长[18-20]。研究结果表明，施用微生物菌剂能显著降低对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸和阿魏酸等5种酚酸类物质在土壤中的积累，并可促进烟株生长，施用双藻菌露200微生物菌剂6 kg/hm2(处理T1)、施用农用微生物菌剂75 L/hm2(处理T2)、施用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌复合粉剂300 kg/hm2(处理T3)的烟株干物质积累量分别为清水对照的124.15 %、111.62 %和126.99 %，前人的研究也有类似结果。

表1 不同处理根际土壤微生物数量

表2 根际土壤微生物数量和酚酸含量的相关性分析

表3 不同处理对烤烟农艺性状和生物量

土壤中细菌、真菌和放线菌的结构和数量影响土壤的微生态平衡。施用微生物菌剂能够加快有益微生物在土壤中的繁殖，改善土壤微生态结构[21-22]。土壤微生物数量测定结果表明，微生物菌剂处理后，烟株根际土壤中三类微生物的数量均显著高于对照组，与高峰等[23]的研究有类似结果。

土壤中的酚酸类物质与土壤微生物关系密切，酚酸类物质能够影响土壤微生物数量和多样性，微生物群落和数量的改变也会影响土壤理化特征的变化[6]，白羽祥、张玥琦等报道酚酸类物质含量与细菌丰度显著相关[17, 24]，呈现出根系分泌的化感物质能够抑制某些病原微生物的生长[9]，土壤微生物能够促进酚酸类物质的转化与分解[25-26]，根系微生物数量与种群的增加能加快这一进程，降低酚酸物质的化感活性。通过对土壤根际微生物数量与酚酸物质含量的相关性的研究，结果表明细菌数量与对羟基苯甲酸、4-香豆酸和阿魏酸呈显著负相关(P<0.05)，放线菌数量与香草酸呈极显著负相关(P<0.01)，微生物菌剂的施用有效增加了土壤微生物的数量，从而降低土壤酚酸物质含量，白羽祥[17]等的研究也有类似结果。

4 结 论

土壤微生物数量与酚酸物质含量存在密切的相互影响关系，施用微生物菌剂能够有效提高土壤微生物丰度，降低根际土壤酚酸类物质含量，对根系土壤微生态环境起到了较好的调节作用，有效促进烟叶生长。