生物农药与生物质发酵肥对烟草根结线虫病害防控效果研究

黄 坤，余 萍，阙劲松，罗红梅，刘春明，陈丽华，张绍松*

(1.云南省烟草公司红河州公司，云南 弥勒 652399；2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所/农业农村部西南作物基因资源与种质创制重点实验室/云南省农业生物技术重点实验室，云南 昆明 650205)

【研究意义】烟草生产过程中常出现多种病害，根结线虫(Root-knot nematode)病是最重要病害之一[1]。根据2002年我国烟草业统计，全国根结线虫病害发生面积为10.83万hm2，直接危害造成的烟叶经济损失7917.84万元，占侵染性病害所致损失的5.7 %[2]。该属的南方根结线虫(Meloidogyneincognita)寄主范围广[3]。因根结线虫危害给烟草生产造成重大经济损失，防控该病害备受关注，研究具有安全、环境友好型、资源良性循环的高效防控策略和技术措施，对增加烟农的收入、提升烟叶质量和改善生态环境均具有重要意义。【前人研究进展】根结线虫主要危害作物的根部，给防治带来困难[4]。早期曾使用溴甲烷[5]、棉隆(Dazomet)[6-7]、涕灭威(Carbanolate,Temik)[8]等对根结线虫进行防治，虽效果良好，但这类化学农药对人、畜和环境危害大[5-8]，近几年已禁用或限制使用。应用生物农药防控根结线虫病害是备受关注的热点领域，自发现阿维菌素 (Avermectins)具有杀线虫活性[9-11]后，近年来，又发现生物碱对根结线虫具有毒杀活性[12]。苏云金芽孢杆菌[13]、厚孢轮枝菌[14]、及淡紫拟青霉[15]等细菌、放线菌与真菌对根结线虫的杀虫活性。利用细菌、放线菌或真菌的活体细胞及其代谢产物、植物活性成分进行根结线虫病害的防控是现代农业的发展趋势。有关病原根结线虫方面，作者曾开展了根结线虫分离和苗期接种方法的探索[16]；病原根结线虫的染色方法研究[17]；烟苗移栽初期病原根结线虫侵入寄主根系组织的检测等[18]。【本研究切入点】在开展烟草根结线虫病害防控研究的基础上，结合红河烟区根结线虫发生的特点，在关键时期，选用防控效果较好的3种生物农药，配合施用生物质发酵肥，采取生物农药、生物质发酵肥与施药关键时期相结合的绿色综合防控策略。【拟解决的关键问题】研究总结出一套生物农药与生物质发酵肥科学配施、选准施用时期与剂量，建立具有显著效果的绿色综合防控策略与技术措施。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

2018年4-12月在云南省红河州建水县临安镇明哨村和云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所内进行试验。

1.2 供试材料

1.2.1 烟草种子与烟苗 烟草(NicotianatabacumLinn)品种：烟草品种为云烟87。田间试验的种子、烟苗培育及其处理由红河州烟草公司建水县分公司南庄烟站提供与实施。

1.2.2 复混肥料 复混肥料属于烟草专用肥，总养分≥45 %(含硝态氮)，N-P2O5-K2O=18-5-25，云南省红河恒林化工有限公司产品。

1.2.3 生物农药 25 %丁硫甲维盐(潍坊万胜生物农药有限公司产品)，水乳剂，总有效成分含量25 %，丁硫克百威含量23 %；甲氨基阿维菌素苯甲酸盐含量2 %。肯邦线尊(泰安市泰山现代农业科技有限公司产品)，颗粒剂，阿维菌素有效成分含量0.5 %，低毒。厚孢轮枝菌(云南微态源生物科技有限公司产品)，微粒剂，有效成分含量2.5亿个孢子/g。

1.2.4 生物质发酵肥 苕子秸秆发酵肥、万寿菊秸秆发酵肥、油萝卜绿色秸秆发酵肥和中药渣发酵肥均由课题组、红河州烟草公司和云南千州生物有机肥有限公司共同研发，利用生物质秸秆或残渣添加菌剂发酵制备而成(试制品)。

1.2.5 仪器与分样筛 解剖镜和显微镜：Olympus SZX10解剖镜、Olympus BX51光学显微镜；分样筛：20、100和600目共3种孔径分样筛。

1.3 试验设计

试验共设8个处理：处理1(CK)，施用复混肥料45 g/株，不施用其它有机肥和防控根结线虫病害的农药；处理2，育苗末期漂池中施用丁硫甲维盐0.077 g/株，移栽前塘施丁硫甲维盐0.18 g/株(1.8 mg/mL溶液100 mL)和油萝卜绿色秸秆发酵肥36 g/株，配施复混肥32 g/株；处理3，育苗末期漂池中施用肯邦线尊0.309 g/株，移栽前塘施肯邦线尊1.36 g/株(按重复小区180株，称取244.8 g，与砂土8755.8 g混匀，塘施含农药砂土50 g/株)和油萝卜绿色秸秆发酵肥36 g/株，配施复混肥32g/株，烟株团棵期揭膜前再次塘施0.909 g/株；处理4，育苗末期漂池中施用丁硫甲维盐0.077 g/株，移栽前塘施厚胞轮枝菌0.909 g/株(按重复小区180株，称取163.6 g，与砂土8836.4 g混匀，塘施含农药砂土50 g/株)和油萝卜绿色秸秆发酵肥36 g/株，配施复混肥32 g/株，烟株团课期揭膜前再次塘施0.909 g/株；处理5，移栽前塘施苕子秸秆发酵肥36g/株，配施复混肥32 g/株；处理6，移栽前塘施万寿菊秸秆发酵肥36 g/株，配施复混肥32 g/株；处理7，移栽前塘施油萝卜绿色秸秆发酵肥36 g/株，配施复混肥32 g/株；处理8，移栽前塘施中药渣发酵肥36 g/株，配施复混肥32 g/株。每处理设3个重复小区，每个小区种植60株烟，株行距为0.40 m×1.10 m，试验区的四周留出2～3株或2～3墒作为保护行。与对照相比，各处理的复混肥料施用量为32 g/株，减少28.9 %。

1.4 试验方法

1.4.1 烟苗培育与移栽后管理 烟苗培育采用漂浮育苗技术，建水县分公司南庄烟站育苗点培育。采用烤烟小苗膜下移栽技术，烟苗移栽后，其它措施按烤烟小苗膜下移栽技术规程进行管理。试验小区烟株不同生长阶段的管理，按烤烟大田种植技术措施进行管理。

1.4.2 烟田根际土壤取样 取样时间：分别在移栽前、移栽后45、90 d和采烤结束4个时期，采集根际土壤样品共4次。取样方法：每重复小区选第15、30和45株烟，共采集3株烟的根际土壤，距烟株15 cm，向下20 cm取土约400 mL(下一次取土样在烟株另一侧，交替取样)根际土壤，装入取样袋，分别记录试验地点、取样时间、处理编号和重复小区烟株编号等。

1.4.3 烟株根际土壤二龄幼虫(J2)检测 采集每个重复小区3株烟的根际土壤，在实验室从个土壤样品中及时量取样品50 mL并将其混匀，取出混匀土样50 mL。土壤中J2数量检测方法同文献[16]，采用高渗蔗糖溶液分离与分样筛分离相结合的分离方法，并在解剖镜下测定每个土壤样品单位体积(50 mL)中J2数量。

1.4.4 烟田根际土壤主要养分检测 团棵期采集的土壤样品，以每个小区3株烟的等体积根际土壤的混合样品作为小区土样，将样品送至云南耘耨科技有限公司检测。检测土壤pH值(NY/T1377-2007)，有机质(NY/T1121.6-2006)，全氮(NY/T1121.24-2012)，水解性氮(LY/T1228.6-2015)，有效磷(NY/T1121.7-2014)和速效氮(NY/T889.6-2004)等6项指标。

1.4.5 烟叶采烤、分级、产量与产值测定 按烟叶采收、烘烤与分级管理要求进行。采烤完毕，称量每个重复小区不同等级的烟叶重量，并按当年收购价计算每个小区的产值。每个小区种植了60株烟，在烟株生长过程中，个别烟株因多种缘由死亡，以最终采烤烟株的数量，计算出小区内单株烟的平均产量与产值，进而折算为公顷产量与产值。

1.4.6 采烤烟叶结束后挖根调查病害危害程度 采烤烟叶结束，按“中华人民共和国国家标准GB/T23222-2008”中烟草病虫害分级及调查方法，采用烟草根结线虫病害地下部分分级与病情指数调查方法。及时挖出尽可能完整的烟株根系，当天调查每个试验小区中每株烟的根系受根结线虫危害的病级，详细记录并计算试验小区烟株的病级与小区病情指数。

病情指数 =

采用不同药剂或生物质有机肥料的处理，与空白对照(CK)相比，即为某种处理的相对防效。

某种处理的相对防效(%)=

2 结果与分析

2.1 烟株根际土壤单位体积中2龄幼虫的数量检测

烤烟移栽前后不同时期4次采集的根际土壤，采用高渗蔗糖溶液离心与分样筛分离相结合的方法，检测单位体积根际土壤中J2数量，结果如图1所示。通过对所检测的50 mL根际土壤中J2数量的数据进行方差分析，试验中8个处理的4次采样检测，其中，第1次采样(F=1.60F0.01=4.28，处理间差异达及极显著水平。第3次采样的检测结果方差分析显示，处理间差异达显著水平，F=2.77>F0.05=2.76。

根据方差分析结果，试验中第1次取样检测的各处理间根际土壤中J2数量差异不显著，总体的根际土壤中J2数量都较少(10～35条/50 mL土)，此时，只是划定试验小区，未对试验地进行任何施药与施肥处理，测定的J2数量只是试验地的背景值。但是，测定数据显示，试验地的土壤中含有J2，各处理与小区间的土壤中J2数量不均一，只是未达到显著差异。该结果提示，试验地在上年度种植烤烟发生根结线虫病害，本次试验所检测的J2中可能含有根结线虫的幼虫。第2次采样的检测结果显示各处理间差异达极显著水平，单位体积根际土壤中J2数量总体较低(4～29条/50 mL土)，比移栽烟苗前的背景值低，同时，出现未作任何处理的空白对照最低，而药剂或施生物质发酵肥处理却较高的现象，分析认为，由于处理1(CK)未施药或施发酵肥，较多的J2已侵入烟株根系，故所检测到的单位体积根际土壤中J2数量较低。施药与施肥的不同处理间， J2侵染进程受到影响，单位体积根际土壤中J2数量相对较高。第3次采样的检测结果，各处理间差异达显著水平，且总体的单位体积根际土壤中J2数量较高(56～164条/50 mL土)，表明根结线虫已完成至少1个侵染循环，并已孵化出大量的J2，同时，以处理1(CK)的J2数量最高，不同施药或施肥处理的J2数量相对较低，该结果佐证了对第2次检测结果的分析。第4次采样的检查结果显示，各处理间的差异不显著，依据单位体积根际土壤中J2数量，处理2和处理4明显低于处理1(CK)，一定程度上反映出这2种农药与肥料对J2产生的抑制效果。由于此次采样距移栽时间约120 d，故侵染的线虫至少已发生2个侵染循环，调查发现，红河烟区在移栽后35 d，烟株根系已产生大量的卵块团，完全可以孵化成J2，由于首个侵染循环至第2个侵染循环过程中所受影响因素较多，同时，施入的药剂或肥料作用时间(或半衰期)存在差异，因而在第4次检测中单位体积根际土壤J2数量出现较大起伏属正常现象。

同一取样时间不同处理数字后不同大小写字母分别表示差异达0.01或0.05显著水平，下同The capital and lower-case letter behind the number with different treatments indicated the significant difference at 0.01 and 0.05 level, respectively, the same as below图1 4个时期烟株根际土壤单位体积(50 mL)中J2数量检测Fig.1 Determination of nematode J2 amount in rhizosphere soil (50 mL) of tobacco plants during 4 growing stage

第2、3次采样检测根际土壤中J2数量，方差分析结果分别显示极显著差异和显著差异。根据几个处理在4个时期单位体积根际土壤中J2数量的变化，初步判断生物农药丁硫甲维盐和肯邦线尊、以及油萝卜秸秆发酵肥施用于烟株根际土壤中，对根结线虫J2具有明显的抑制效果。

2.2 采烤烟叶结束后挖根调查根结线虫危害程度

试验中的8个处理，处理1(CK)的病情指数最高，处理3病情指数最低，为24.00(相对防效为67.1 %)；其次处理8的病情指数为28.37(相对防效为61.1 %)；处理2的病情指数为36.20(相对防效为50.4 %)。其它处理对烟株根结线虫病害均有不同程度的防控效果。进一步分析显示，8个处理间的病情指数差异达极显著水平，处理间F=4.64>F0.01=4.28，表明移栽烟苗前各处理与处理1(CK)具有极显著的差异。处理1(CK)的平均病情指数为73，高于药剂或生物质发酵肥处理后的病情指数。新复极差测验显示，只有处理7(中药渣发酵肥)与处理1(CK)在同一水平上，该结果与单位体积根际土壤中J2数量的检测结果相对应。

图2 各处理病情指数Fig.2 Disease index investigation of root-knot nematode with different treatments

图3 各处理采烤烟叶的产量Fig.3 Yield of cured tobacco leaves with different treatments

图4 各处理采烤烟叶的产值测定Fig.4 Output value determination of cured tobacco leaves

2.3 采烤的烟叶分级、产量测定与产值测评

从图3～4可见，平均产量以处理1(CK)最低，为2535.0 kg/hm2；最高产量是处理3，为3278.55 kg/hm2；其次是处理8，为3172.05 kg/hm2；处理7的产量最低，为2982.00 kg/hm2。该结果与病害调查结果相一致。8个处理重复小区折算的每公顷产量进行方差分析，处理间差异达极显著水平，F=6.33>F0.01=4.28，表明不同生物农药或生物质发酵肥对烟叶产量的影响存在极显著的差异。通过新复极差测验，施药剂和施有机肥料的各处理在同一水平，但与处理1(CK)差异极显著。有关产量方面新复极差测验的结果与病情指数的测验结果相一致。

从图4可见，不同处理的产值排序与产量排序基本一致。方差分析的结果显示，F=5.48>F0.01=4.28，各处理间产值的差异达到极显著水平。移栽烟苗前的不同药剂处理及空白处理间具有极显著的差异。产值最高的处理3，为89 200.20元/hm2；其次是处理8，为88 612.50元/hm2；处理7产值为8296.05元/hm2。通过新复极差测验，施药剂和施肥的各处理在同一水平，但与处理1(CK)差异极显著，与上述产量方面及根结线虫病害方面的分析结果相一致。有关产值方面的方差分析结果与产量及病情指数的分析结果相印证。

2.4 烟田土壤主要养分检测

土壤样品在6月12-14日采集，当时已培土，有些处理已进行第3次施药。烟株生长至团棵期。根据检测结果，除了中药渣发酵肥、万寿菊秸秆发酵肥和厚孢轮枝菌各处理中土壤pH值低于处理1(CK)(表1)，及厚孢轮枝菌或苕子秸秆发酵肥各处理中速效钾含量低于处理1(CK)，其它的数值均高于处理1(CK)，该结果表明在减施复混肥28.9 %的条件下，配施600 kg/hm2的生物质发酵肥，土壤主要养分高于常规只施750 kg/hm2复混肥的处理1(CK)。而且上述试验处理的烟叶产量与产值也高于处理1(CK)。进一步对试验小区6项指标的数据进行方差分析，各项指标的F测验值均小于F0.05=2.76(表1)，表明这6项指标各处理间的差异不显著，说明在配施生物质发酵肥与施药条件下，减施复混肥28.9 %，可以满足烟株生长需求。

表1 烟田土壤主要养分含量

从表1及其源数据还可以看出，多数试验处理土壤的有机质、全氮、水解性氮、有效磷和速效钾含量均比处理1(CK)高，只是因为田间土壤所受影响因素较多，检测获得的结果波动性大，方差分析结果显示处理间差异不显著。但配施所研发的发酵肥，可将复混肥减少至450 kg/hm2。

3 讨 论

栽培作物的土壤中含有各类线虫，包括腐生性线虫和寄生性的病原线虫。根结线虫属于内寄生的病原线虫。栽培地的作物发生根结线虫病害之后，病原根结线虫的幼虫和卵的数量会显著增加[7-9]。研究中试验地是上一年种植烤烟并发生较重的根结线虫病害的烟田，移栽前土壤中存在一定数量的J2。而且，检测到的J2有腐生性和寄生性的，包括病原根结线虫的J2。曾探索到移栽烟苗后，室内和田间J2最早侵入根系的时间为6 d[18]，以此推测首批侵入根系的J2为土壤中已存在的，后续侵入根系的有可能是土壤中移栽烟苗后卵孵化的幼虫。研究组已开展了大量的土壤样品中J2数量检测，检测的样品中有的数量极高，可能所采样品来自发病较重的根系区域和采样时间恰好是根系上卵块大量孵化的时间，故出现个别样品单位体积(50 mL)土壤中J2数量达到2000条以上的现象。从第4次采样时期推测，病原根结线虫有可能已发生2～4个侵染循环，故检测结果存在波动性大，方差分析较难出现处理间差异显著的现象。此外，不论药剂或生物质发酵肥，对根结线虫的作用均具有时效性。再者，土壤是微生物的大本营，会存在降解各类活性成分的微生物及其分泌的酶类。因而，后期的检测结果中各处理间一般不会存在差异显著的现象。

参试的丁硫甲维盐和肯邦线尊农药中均含有阿维菌素类成分。阿维菌素对病原线虫具有毒杀作用[9-11]，迄今，阿维菌素类农药可广泛应用于防控根结线虫病害，较安全的环境友好型生物农药。其中还含有生物碱。近年来，范玉娇等报道了关于生物碱杀线虫活性的研究[12]。有关生物碱杀线虫将是一个研究热点。杨章明等报道了利用万寿菊与厚孢轮枝菌防治烟草根结线虫病害的效果[14]，显示研究目标越来越多聚焦到根结线虫病害的生物防控方面。

研究生物质发酵肥，选择苕子秸秆发酵是因为其属豆科植物，较早被用作绿肥作物[21]。选择中药渣作为生物质发酵原料，主要是近些年废弃中药渣已危害到生态环境[22-23]，中药渣的主要原料是植物秸秆，加工成有机肥既解决了其危害性，又将废弃物资源化利用，植物秸秆还田极大有利于生态环境。油萝卜秸秆用于发酵肥原材料，主要原因是油萝卜具有抗甜菜孢囊线虫[24]和四种根结线虫[25-26]，利用油萝卜秸秆进行发酵，制备有机肥，除作有机肥料，还可防控根结线虫病害。

4 结 论

种植烟草过程中，在育苗末期、移栽前和团棵期分别将阿维菌素类生物农药与油萝卜秸秆发酵肥配施，可减少复合肥28.9 %的施用量，并有效防控烟草根结线虫病害，产量与产值显著提高。

致 谢：徐宏韬和杜潮庚同学在实习期间参与了本研究的工作，特此感谢！