颅面骨畸形基因学研究进展

黄元亮 滕利

【提要】 颅面骨畸形是颅面外科基因学研究的重点。颅面骨畸形的致病突变基因及相关致病因素现已逐渐明确，针对突变基因的分子治疗亦取得一定的进展，为颅面骨畸形的早诊断、早治疗奠定了基础。本文针对颅面骨畸形的基因学研究、基因突变的分子治疗进展进行综述。

颅颌面外科基因研究主要针对颅面骨畸形，所涉及的颅面骨畸形主要包括颅缝早闭和颅面裂。颅缝早闭分为综合征型和非综合征型。综合征型患者不但患有颅缝早闭，同时还会合并其他症状。颅面裂畸形是一种较为罕见的先天性畸形，以胚胎时期面部骨各突起间未融合而产生的面骨裂为主要症状。

1 颅缝早闭基因研究

综合征型颅缝早闭遗传机制相对较为明确。大多综合征型颅缝早闭源于FGFR1-3(成纤维细胞生长因子受体1-3)及TWIST基因突变。1993年，Jabs等[1]首次描述了MSX2基因突变导致了一个家族的三代人都患有波士顿型颅缝早闭症。自此，综合征型颅缝早闭的基因研究得以广泛开展，许多综合征及其突变基因相继被报道：Pfeiffer综合征与FGFR1相关[2]，Apert、Crouzon、Pfeiffer、Jackson Weiss和Beare Stevenson综合征与FGFR2相关[3-8]，Muenke综合征、Crouzon综合征伴黑棘皮症与FGFR3相关[9-10]，Saethre-Chotzen综合征与TWIST1相关[11]，波士顿型颅缝早闭综合征与MSX2相关[1]，Carpenter综合征与RAB23相关[12]，颅额鼻综合征与EFNB1相关[13]等。截至2015年，共发现57个与颅缝早闭相关的基因突变。这些基因可分为两类：第一类，引起该基因编码蛋白的改变，直接导致颅缝早闭，此类为形成颅缝早闭的核心基因；第二类，使人体成骨功能紊乱，仅在部分病例中引起颅缝早闭[14]，如低磷血症中的磷钙失衡(ALPL基因突变)[15]和X连锁低磷性佝偻病(PHEX基因突变)[16]。2017年，Goos等[17]补充描述了新增的可能与颅缝早闭相关的22个基因。这些基因通过作用于胚胎发育相关的通路(如：Sonic hedgehog通路、WNT通路、NOTCH/EPH通路、RAS/MAPK通路、Indian hedgehog通路、视黄酸通路、STAT通路等)影响胚胎早期发育，造成颅缝早闭。除基因突变外，环境因素也是颅缝早闭的重要因素，非综合征型颅缝早闭及某些综合征型颅缝早闭可能是多基因和环境因素共同作用的结果[18]。随着基因技术的发展，非综合征型颅缝早闭的基因学研究也取得了一定进展，通过非综合征型矢状缝早闭的全基因组关联研究(Genome-Wide Association Studies，GWAS)[19]确定了两个与非综合征型矢状缝早闭显著相关的位点，一个位于BMP2的下游，另一个位于BBS9的内含子内。该结果为从基因层面解释非综合征型颅缝早闭的病因提供了基础，但具体的机制目前仍不明确，有待于进一步研究。

2 颅面裂基因研究

颅面裂的病因复杂，Saadi等[20]发现细胞骨架蛋白SPECC1L可以调控颅面各突起在发育过程中细胞的迁移和黏附，其缺失可导致面斜裂的发生。Gfrerer等[21]通过敲除斑马鱼的SPECC1L基因，制作了面裂的动物模型，这是第一个通过基因修饰成功制作的颅面裂动物模型。Jugessu等[22]的基因分析结果显示，IRF6、ADH1C、FGF12、ALX3、MKX、PDGFC、ETV5七种基因与面裂相关，其中IRF6基因突变最为常见。Thompson等[23]通过动物实验敲除小鼠IRF6基因，观察到了新生小鼠的颅面裂畸形。随着基因研究的不断深入，在颅面裂领域有了新的发现。Shull等[24]报道甲基化等组蛋白修饰的缺失，可能对颅面裂的产生有重要影响。该研究通过敲除Prdm3和Prdm16基因，成功观察到了斑马鱼及小鼠动物模型的颅面裂的发生。

颅面裂具有遗传异质性及基因多效性。Takahashi等[25]观察到一对日本同卵双胞胎患有单侧唇腭裂，但受累区在不同侧。全基因组测序未发现DNA有不一致的变异。该研究表明，表观遗传可能是颅面畸形性状的决定性因素。全基因组关联研究(GWAS)的发展推动了颅面裂畸形的基因层面研究，Yu等[26]对中国多种族共7 404例非综合征型口面裂和16 059例非综合征型唇腭裂进行GWAS，检验其遗传异质性，共得出41个非综合征型唇腭裂的可疑致病性单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，这为进一步探究非综合征型唇腭裂的致病突变基因位点打下基础。

3 基因突变的分子治疗进展

手术治疗是颅面畸形的主要治疗方法，其对症治疗效果显著，且避免了药物治疗的潜在风险。但手术为有创治疗，且术后存在畸形复发的可能。如何针对已知的突变基因进行对因治疗，是亟待解决的问题。

综合征型颅缝早闭的遗传机制研究明确，能够满足治疗的前提。成纤维生长因子受体(FGFR)及其配体具有调节身体发育及肿瘤形成的功能，其中FGFR1-3参与了骨骼发育形成。FGFR功能的异常高表达是综合征型颅缝早闭发生的主要原因之一。阻止FGFR的异常表达，是颅缝早闭基因治疗研究的重要切入手段。1992年，Ueno等[27]首次报道了截断型FGFR-1能抑制FGF配体的信号转导。2001年，Greenwald等[28]将截断型FGFR-1注入孕期胎鼠的后额缝，发现胎鼠出生后，后额缝的正常融合受到抑制。这表明，通过干扰FGFR功能，可以阻止颅缝的融合。2006年，Perlyn等[29]采用酪氨酸激酶抑制剂(可靶向抑制异常的FGFR信号)对Crouzon综合征模型鼠颅骨进行体外培养，发现其能抑制冠状缝早闭的发生。同年，Eswarakumar等[30]通过基因编辑，将突变片段L424 A、L426 A插入Crouzon综合征模型鼠，以阻止接头蛋白Frs2a的募集及酪氨酸磷酸化，干扰FGF下游信号通路的表达，结果发现Crouzon综合征基因编辑小鼠冠状缝早闭症状明显改善。2007年，Shukla等[31]尝试对孕有Apert综合征幼鼠的母鼠腹腔注射酪氨酸激酶抑制剂(U0126)，发现部分小鼠表现出良好的治疗效果。2009年，Cooper等[32]采用Noggin对颅缝切除术后小鼠进行处理，发现Noggin可以明显抑制术后颅缝再次融合。2018年，Luo等[33]通过体外实验筛选了特异性阻止FGFR2-P253R突变的等位基因表达小干扰RNA(siRNA)，用于处理Apert小鼠(Fgfr2+/P253R)颅骨细胞的体外培养，结果发现其能有效抑制成骨细胞分化及骨组织矿化作用。随后通过腺病毒转染的方法，将具有拮抗突变FGFR2功能的AAV9-Fgfr2-shRNA注射入Apert小鼠颅骨，发现能够有效改善小鼠的颅缝早闭症状。同年，Shin等[34]通过杂交Fgfr2S252 W/+Apert综合征小鼠与PIN1+/-小鼠，发现其后代Apert综合征症状明显减轻，提示PIN1抑制剂可能是治疗FGFR突变颅缝早闭的潜在靶点药物。

近20年来，围绕如何抑制突变FGFR的异常功能展开的深入研究，已经在动物实验中取得较大突破。但离临床实际应用尚有差距。在治疗方面仍存在不可忽视的问题，如安全剂量、给药途径、远期效果及潜在并发症等均有待于进一步的评估。

4 基因研究展望

随着基因诊断技术和基因编辑技术等的快速发展，从基因层面解释畸形成因和机制，使畸形的预防、干预和治疗成为可能。基因技术的进步和应用会进一步推动颅颌面外科快速发展，但由于某些畸形(如面裂、非综合征型颅缝早闭)的发生是遗传及环境共同作用的结果，基因干预并不能准确预测其发展，此外还存在基因编辑所带来的伦理问题。如何合理运用基因技术、合理看待基因诊断结果，以及如何正确使用基因编辑技术，是当前临床面临的巨大机遇和挑战。