脐带间充质干细胞在组织工程中的应用

韩倩倩 曲明悦 李静莉 王春仁

【提要】 组织工程作为一种新的组织器官修复方法方兴未艾，对其种子细胞的研究也从成体细胞更多地转向干细胞。胚胎干细胞、诱导多功能干细胞和多种成体干细胞均被用于构建新的组织或器官，如皮肤、骨和软骨、神经、心血管等。本文对脐带间充质干细胞应用于组织工程和再生医学中的相关研究进展进行综述。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)最初是从骨髓单核细胞中分离出来[1]，后从脐带[2]、胎盘[3]、关节滑液[4]、脂肪[5]、胰岛[6]、真皮[7]、牙龈[8]、外周血[9]、肩胛下囊[10]等多种组织中获得。因具有独特的增殖、多向分化潜能、营养能力、归巢/迁移和免疫抑制等生物学功能，而日益受到重视[11]，成为组织工程与再生医学的理想的种子细胞。

脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)是存在于脐带中的一类间充质干细胞，于2000年在脐带血(UCB-MSCs)[2]中被发现，后逐渐从脐带的华通氏胶(WJ-MSCs)[12]和血管周围组织(PVT-MSCs)[13]中获得。UCMSCs表达MSCs共有标志物CD44、CD73、CD90和CD105，并缺乏内皮/造血细胞的标志物CD31、CD34、CD45、CD79，此外PVT-MSCs特异性表达内皮细胞表面标志物CD146。相对于其他干细胞，UCMSCs的优势在于：①取材简单方便，取自新生儿脐带，供应充足，且对供体无伤害[14]；②增殖分化能力强，其体外增殖能力优于BMSCs，且不受供体年龄限制[11，15]；③细胞较原始，可表达胚胎干细胞标志物Oct-4、Nanog、Sox-2和ITSN1[16]，但不存在伦理问题；④免疫原性更低，表达低水平的MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子和效应T细胞诱导所需的共刺激分子CD40、CD80、CD86，并表达高水平的能够抑制免疫细胞增殖分化的分子HLA-G、IDO和PGE2等[17]；⑤具有免疫调节作用，可高表达CD200、CD273、CD274等免疫调节表面蛋白和IL1β、IL-8、LIF和TGF-β2等细胞因子，在免疫抑制方面优于BMSC[11，17-18]。

UCMSCs参与人体修复的方式主要有：细胞分化、免疫调节、分泌多种细胞因子。现阶段，UCMSCs越来越多地参与组织器官的重建，本文针对脐带间充质干细胞在组织工程与再生医学中的应用进行综述。

1 在骨再生领域的应用

因BMSCs使用的诸多限制[19-20]，UCMSCs在骨修复和再生领域被大量研究，以期作为BMSCs的替代物。UCMSCs的体内外成骨分化能力已被证实[21]。DAY等[22]比较了BMSCs和UCMSCs在珊瑚羟基磷灰石/碳酸钙上的成骨能力，虽然从表征、ALP、osteocalcin和Runx2的表达等方面均显示出BMSCs的优越性，但UCMSCs依旧能成功进行体外成骨分化。Diao等[23]将UCMSCs载入nHAC/PLA仿生骨支架材料，皮下植入BALB/c裸鼠背下4～12周，结果显示在裸鼠体内成骨且源自UCMSCs。Ciavarella等[24]从基因水平证明UCMSCs具有和BMSCs相同的成骨机制，即可高表达成骨转录因子RUNX2的共同激活因子TAZ，从而促进新骨形成。Panepucci等[25]表示，尽管hUCMSCs在表达成骨有关的基因方面不如BMSCs，但可通过金属蛋白酶和血管生成表达更多参与基质重塑相关的基因，参与组织重建。Wang等[26]将hUCMSCs接种在生物功能化大孔磷酸钙骨水泥(CPC)上，体外培养14 d后植入8 mm全厚度颅骨缺损大鼠模型，12周后进行Micro CT、免疫组化和组织形态学分析，显示hUCMSCs联合CPC能显著增加新生血管和新骨的再生。此外，hUCMSCs与聚乳酸-乙醇酸纳米粒联合植入也能到达良好的效果[27]。Ye等[28]建立了兔股骨髁缺损模型，植入加载hUCMSC的自组装仿生矿化胶原支架，提高了骨缺损的愈合速度。相关研究表明，RGD功能化聚氨酯支架[29]、含GHK肽的氧化海藻酸水凝胶[30]均能通过基因表达、ALP活性和骨细胞外基质沉积等促进hUCMSCs的成骨分化。

2 在软骨再生领域的应用

hUCB-MSCs在软骨分化和损伤修复中显示出优良的效果。研究显示hUCB-MSCs培养在Ⅰ/Ⅲ型胶原海绵中可成功分化为软骨细胞，并表达Ⅱ型胶原蛋白[31]。将hUCB-MSCs混合4%透明质酸水凝胶后，分别植入大鼠[32]、兔[33]、猪[34]的双膝股骨滑车处全厚度关节软骨缺损部位，组织学和形态学上均显示出优越的软骨修复能力，没有骨转化和修复退化的迹象。Kim[35]将UCB-MSCs接种于特制的细胞凝聚诱导网支架，体外软骨分化显示糖胺聚糖合成明显增多，软骨生成标志物表达明显上调，兔关节软骨缺损模型中也显示了有效的软骨修复。Jeong等[36]通过兔全层软骨损伤模型，验证了hUCB-MSCs修复软骨缺损的旁分泌机制，即在病变区微环境刺激下，激活Notch信号通路，TSP-2分泌增加，促进内源性软骨生成细胞的分化。

hWJ-MSCs也是软骨组织工程中干细胞的替代来源。将hWJ-MSCs植入海藻酸/透明质酸水凝胶，在不添加生长因子的情况下培养28 d，即可显示强烈上调的软骨特异性转录表达[37]。Zhang等[38]用加载hWJ-MSCs的脱细胞软骨细胞外基质定向支架修复山羊的全厚度股骨髁关节软骨缺损，结果显示，与单纯支架组相比，hWJ-MSCs组的软骨质量较高，软骨下骨完整；组织学染色显示，hWJ-MSCs组细胞外软骨、软骨腔隙和Ⅱ型胶原水平更高，并且具有更高的弹性模量。此外，类黄酮修饰的3-氨基丙基-三乙氧基硅烷支架[39]、丝素/透明质酸支架[40]、壳聚糖-琼脂糖支架[41]与hWJ-MSCs共培养均能促进hWJ-MSCs向软骨细胞分化。除了关节软骨修复，将hWJ-MSCs加载在含RTGF-β3的核壳型纳米纤维支架上也表现出良好的生物相容性，后者有望用于构建气管软骨再生组织工程支架[42]。

3 在皮肤再生领域的应用

皮肤创伤修复是一项重大挑战，创伤、烧伤、感染、糖尿病足部溃疡等多种损伤均能破坏皮肤的正常结构。伤口愈合是一个复杂的过程，包括炎症、增殖和重塑。UCMSCs对促进伤口修复具有强大的作用。UCMSCs可分化成表皮样细胞[43]、真皮乳头样组织[44]、汗腺样细胞[45-46]等，也可通过旁分泌机制促进正常皮肤成纤维细胞的增殖和迁移，上调再上皮化、新生血管化和纤维增生的基因表达，促进全厚度皮肤切除模型小鼠的伤口愈合[47-48]。

应用胶原-壳聚糖激光-ADM复合材料加载微胶囊化VEGF基因修饰的hUCMSCs修复猪的皮肤伤口缺损，结果显示其能改善组织工程真皮的血管化，加速创面愈合[49]。明胶-甲基丙烯酸水凝胶中包裹UCMSCs和脐静脉内皮细胞构建三维共培养体系，细胞增殖、细胞外基质沉积和血管生成基因的表达在体外均得到了显著改善，可与宿主组织良好整合并增强了角质形成细胞的增殖和分化[50]。壳聚糖水凝胶-hWJMSCs复合物治疗雄性大鼠背部皮肤8 mm深的圆形伤口，不同时间点的组织学观察表明，其能显著减少TNF-α和IL-1β等炎症因子分泌，抑制过度炎症；提高胶原沉积和角质形成细胞成熟标志物k1(keratin 1)的表达，促进伤口闭合、微循环、组织重塑、再上皮化和毛囊再生[51]。此外，海藻酸钙凝胶多孔支架[52]、脱细胞真皮基质[53]、SIS水凝胶[54]等支架与UCMSCs复合均有良好的促进皮肤愈合的效果。上述研究表明，UCMSCs可促进新生血管、再上皮化和上皮化后皮肤附属物的生成，未产生与治疗相关的严重并发症或不良反应，在皮肤再生中有巨大的应用潜力。

4 在心血管再生领域的应用

UCMSCs在血管重塑和移植方向有明显优势。UCMSCs有较高的增殖能力[55]和优于BMSCs的血管生成能力[56]。UCMSCs可高表达金属蛋白酶和血管生成相关的基因和蛋白[25]，其外泌体以剂量依赖的方式促进内皮细胞的增殖、迁移和成管，并通过Wnt4诱导内皮细胞中β-连环蛋白的活化发挥了促血管生成的作用，促进了大鼠皮肤烧伤模型的伤口愈合和血管生成[57]，证明其可通过旁分泌促进血管生成。此外，hUCMSCs可分化成内皮样细胞，形成的毛细血管网络有更高的总小管长度、直径和面积[58]；在TGF-β1的刺激下可以分化成血管平滑肌细胞，在体外表现出收缩能力，在体内可支持血管结构的形成，并可迁移至去细胞化的小鼠主动脉中，产生血管平滑肌层[59]。

Zhang等[57]证明，hUCMSCs外泌体mir-675包裹在丝素水凝胶中可促进小鼠缺血后肢的血液灌注。Ghorbel等[60]用猪小肠黏膜下层联合hUCB-MSCs衍生的VSMCS替换仔猪的肺动脉，6个月后移植处由均匀的内皮和多层肌肉组成，而单纯支架组则表现为斑块状内皮细胞层和较薄的肌肉层，显示hUCB-MSC重塑血管的正向作用。Yang等[61]把hUCMSCs作为非心肌细胞成分，与心室肌细胞、3D大孔氧化铁支架共同构建人心室特异性心脏组织，体外可表现正常的电生理，植入急性心肌梗死大鼠梗塞部位可有效促进受损心脏功能的恢复，显著改善左心室功能、梗死面积、血管密度和细胞增殖。

5 在神经再生领域的应用

hUCMSCs可分化成神经样细胞[62-64]，并表达多种神经营养因子，促进受损神经的恢复[65]。其外泌体通过下调TNF-α、MIP-1α、IL-6和IFN-γ等炎性细胞因子，可减轻损伤区域的炎症，促进脊髓损伤愈合和功能恢复[66]。体内注射该外泌体可明显恢复脊髓损伤大鼠的后肢运动功能，使神经丝阳性纤维长度增加，病变部位周围生长锥状结构改善，并产生大量神经营养因子和神经营养蛋白。Pan等[67]的研究表明，将hUCMSCs加载在负载神经生长因子的肝素化胶原支架上，可使兔喉返神经损伤处的电生理学、组织形态学、蛋白表达和疼痛水平接近正常。Jiao等[68]以hUCMSCs结合丝素/海藻酸盐/胶质细胞系衍生神经营养因子支架修复脊髓损伤，结果显示可明显减轻炎症反应，增强脊髓瘢痕扩展，增加存活神经元数量，恢复开放性运动功能。此外，Bahrami等[69]证明，异吗啡胺作为SHH信号激活剂，可促进WJ-MSCS在PCL支架上向运动神经元样细胞分化，为组织工程修复神经提供思路。

6 在肝脏再生领域的应用

UCMSCs可分化成肝样细胞[70-71]，在3D支架中培养的细胞分化增强，可改善细胞形态、肝脏标志物表达和代谢活性[72]，且在三维的猪脱细胞肝支架中培养比传统单层培养具有更低的免疫原性表型和更高的免疫抑制能力[73]，显示UCMSCs结合组织工程支架比单纯细胞治疗更具优势。UCMSCs通过旁分泌机制可改善大鼠肝纤维化[74-75]，其分泌体MFG-EGF-8能强烈抑制TGFβ信号转导，减少小鼠细胞外基质沉积、肝纤维化和急性肝衰竭[76]。早期外周静脉输注UCMSCs可显著抑制急性肝衰竭猴循环单核细胞在肝脏的聚集和成熟及IL-6分泌，改善其肝脏组织学、系统稳态和生存率[77]。Su等[78]在聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯-co-3-羟基己酸酯)支架上加载UCMSCs 或UCMSCs源性肝细胞样细胞，植入肝损伤小鼠体内，发现能显著促进损伤肝脏的恢复，28 d后显示出与正常肝脏相似的组织结构。Chetty等[79]首次用近红外荧光纳米晶体对UCMSCs进行快速标记，开发出具有98%标记效率的新型纳米生物结合物，与氧化锌NCS结合经尾静脉注射到对乙酰氨基酚诱导的肝损伤BALB/c小鼠模型中，3 d内未观察到明显的炎症、坏死或凋亡，显示了UCMSCs的肝脏再生功能。

MSCs在组织工程与再生医学中的应用价值已经得到肯定，但仍面临许多问题与挑战：①干细胞的培养、冷冻保存、临床应用需要标准化，如严格的无菌培养，避免异种或成分不明的培养基成分，用无血清培养基代替含血清培养基、优化冷冻保存的方法和标准化的大规模生产等；②完善干细胞的质量控制方法，细胞表面标志物有待建立新的标准[80-81]；③组织修复的作用机制需进一步阐明。总体而言，UCMSCs对多种组织的修复都具有良好的效果，有望结合支架材料后实现组织的修复和再生，在组织工程与再生医学领域具有良好的广阔的应用前景。