甘蔗近缘野生种蔗茅EfGRAS基因克隆及表达分析

沈先岳 谷书杰 谢林艳 钱禛锋 曾丹 何丽莲 李富生

摘  要：为深入挖掘甘蔗品种的抗旱性能，本研究挑选甘蔗品种中参与调控抗旱机制的主要转录因子GRAS的基因进行表达分析。从转录组数据库中调取GRAS转录因子基因序列信息，采用RACE-PCR和qRT-PCR技术从‘蔗茅99-2中克隆得到1个GRAS基因，将其命名为EfGRAS（GenBank登录号MT499789），并对其进行生物信息学分析与干旱胁迫表达分析。结果表明，EfGRAS基因编码547个氨基酸，CDS全长1644 bp，该蛋白的分子式为C2645H4149N747O816S21，相对分子质量为60.14 kDa，不稳定系数为54.85，脂肪系数为84.37，GRAVY值为?0.293，是一类不稳定蛋白和亲水蛋白;亚细胞定位表明其位于细胞核内，EfGRAS蛋白主要的二级结构是α-螺旋和无规则卷曲，与高粱亲缘关系最近;qRT-PCR分析显示，受到干旱胁迫后，‘蔗茅99-2中基因表达量相比于对照组上调约57.6倍，‘滇蔗01-58中基因表达量相比于对照上调约27.4倍，‘崖城89-9中基因表达量相比于对照组上调倍数较低。本研究结果为进一步研究EfGRAS基因在甘蔗中的功能提供理论基础。

关键词：蔗茅;干旱胁迫;EfGRAS基因;克隆;表达分析

中图分类号：S566.1;Q78      文献标识码：A

Abstract： In order to make deeper research into the drought resistance of sugarcane varieties， the genes of GRAS which playing an important role in the regulation of drought resistance mechanisms in sugarcane varieties for expression analysis were studied. In this experiment， we firstly retrieved the GRAS transcription factor gene sequence information from the transcriptome database， and used RACE-PCR and qRT-PCR techniques to clone a GRAS gene from ‘Sucrose 99-2 and namde it EfGRAS （GenBank registration No. MT499789）， then the bioinformatics analysis and expression analysis under drought stress were conducted on the EfGRAS gene. The results showed that the EfGRAS gene could encode 547 amino acids with a CDS 1644 bp in length， the molecular formula of the protein was C2645H4149N747O816S21， the relative molecular mass was 60.14 kDa， the instability coefficient was 54.85， the fat coefficient was 84.37， and the GRAVY value was ?0.293， which was a class unstable and hydrophilic protein. The subcellular location indicated that it was located in the nucleus. The main secondary structure of EfGRAS protein was α-helix and random coils， which were closely related to sorghum; qRT-PCR analysis showed that after drought stress， the gene expression in ‘Sugarcane 99-2 was up-regulated by about 57.6 times compared to the control group， and the gene expression in ‘DZ 01-58 was up-regulated by about 27.4 times compared to the control group. Compared with the control group， the gene expression level in ‘YC 89-9 had a lower fold of up-regulation. The results would provide a theoretical basis for the further study on the function of EfGRAS in sugarcane.

Keywords： Erianthus fluvus; drought stress; EfGRAS gene; clone; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.10.017

甘蔗（Saccharum spp.）是禾本科多年生熱带作物，属于无性繁殖的C4作物，其种植最早起源于中国[1-2]。作为主要的制糖类经济作物，在我国南方地区甘蔗种植面积较广[3-4]。中国85%左右的甘蔗种植面积为旱地，干旱成为限制中国甘蔗生产的首要环境因素[5]。干旱严重影响了甘蔗的产量和品质，随着甘蔗品种抗旱性能研究的不断深入，选育出高产、稳产、抗旱能力强的甘蔗品种及挑选最佳的亲本材料成为我国目前甘蔗研究的首要任务[6]。蔗茅（Erianthus fulvus Ness.）是禾本科甘蔗亚族蔗茅属的一个野生种，具有早熟、含糖量高、抗逆性强等特点[7]，其在高海拔寒冷的气候条件下和干旱严峻的荒坡上都可以生长，甚至在陡峭的石壁岩缝和成土母质上也可见到蔗茅，表现出极强的抗寒、抗旱和耐瘠能力，宿根性强、抗锈病等优异特性，容易开花且花粉量极多，目前只在中国收集、保存并展开相关的研究，是一种极其珍贵的种质资源[8-10]。

GRAS转录因子只在植物中存在，GRAS蛋白拥有着独特的结构域，根据对模式植物拟南芥和水稻的GRAS基因家族遗传分析，可将GRAS基因家族划分为8个亚族（LISCL、PATI、SCL3、DELLA、SCR、SHR、LS和HAM），其中拟南芥、水稻、烟草、胡杨、大白菜、佛手、辣椒和独行菜的GRAS家族基因响应了干旱、低温和激素等胁迫。马洪双等[11]从胡杨中得到抗旱基因PeSCL7，包含可能与干旱胁迫、病害胁迫等应答元件。张焕欣等[12]利用生物信息学方法进行系统鉴定和进化分析表明，辣椒的大部分GRAS家族基因能够响应PEG6000和盐胁迫。杨辉等[13]从烟草品种NC89克隆的NtGRAS在低温（4 ℃）、NaCl（200 μmol/L）和干旱下均可诱导NtGRAS基因表达上调。殷龙飞等[14]以玉米为材料，发现ZmGRAS31在玉米中响应了抗旱、抗寒及抗盐等逆境胁迫，推测ZmGRAS31可提高玉米的抗逆性。韩雯毓等[15]利用qRT-PCR技术检测干旱和盐胁迫下蓖麻根、茎和叶不同组织中5个基因的表达，发现RcGRASs在不同组织中的表达存在差异性，其中RcGRAS14、RcGRAS21、RcGRAS35的基因表达量上调，RcGRAS1、RcGRAS10的基因表达下调。

研究甘蔗野生种蔗茅的抗旱相关基因，对未来提高甘蔗产量、品质有着重要意义。本研究以‘蔗茅99-2‘滇蔗01-58和‘崖城89-9及其转录组数据为试验材料和基础，对EfGRAS基因进行克隆以及生物信息学分析，同时采用qRT-PCR技术检测干旱胁迫下EfGRAS基因的表达情况，以期为甘蔗抗旱机制的后续研究提供科学依据。

1  材料与方法

1.1  材料

供试材料为‘蔗茅99-2‘滇蔗01-58和‘崖城89-9，均由云南农业大学甘蔗研究所提供，在材料苗期分别取其对照组（正常浇水）及处理组（干旱胁迫处理）的+1叶。取样时间为9：00，剪取后立即放入?80 ℃冰箱保存备用。

1.2  方法

1.2.1  总RNA提取及cDNA鏈合成  利用TRNzol Universa试剂盒提取总RNA，cDNA链的合成利用FastKing一步法合成反转录cDNA试剂盒。

1.2.2  引物设计及基因表达分析  根据基因的序列，qRT-PCR使用NCBI Primer Blast以及Primer 5.0设计其引物，内参基因选用阙友雄等[16]设计的25S引物序列，具体见表1。

PCR程序采用两步法在ABI-7500仪器上进行qRT-PCR。反应程序为：95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸60 s，采集荧光信号共40个循环，每个样品设置3个重复。反应结束后从qRT-PCR的扩增曲线中得到Ct值，采用2?Ct算法计算差异表达基因的相对表达量。

1.2.3  EfGRAS基因克隆  根据EfGRAS基因的序列，使用NCBI在线软件Home-ORF Finder找到基因的开放阅读框，然后通过NCBI的Primer- BLAST设计目的基因的扩增引物（表2）。基因扩增的PCR反应程序为：98 ℃ 20 s;98 ℃ 10 s，53 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃ 10 min。

1.2.4  EfGRAS基因生物信息学分析  EfGRAS蛋白的氨基酸组成、理论分子量和等电点利用Protparam在线软件分析;EfGRAS蛋白的亲疏水性利用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）在线软件进行预测分析;利用ProtComp Version 9.0对EfGRRAS蛋白亚细胞定位进行分析;通过NCBI的CDD（conserved domain database）进行结构域预测;利用SOPMA软件对EfGRAS蛋白的二级结构进行分析;利用Swiss- modle在线软件对EfGRAS蛋白的三级结构进行预测;通过NCBI的Blastx进行搜索不同物种间氨基酸序列，再利用DNAMAN 6.0进行同源性分析，系统进化树由MEGA7.0软件构建。

2  结果与分析

2.1  RNA的检测结果

提取正常浇水及干旱胁迫处理的‘蔗茅99-2‘滇蔗01-58‘崖城89-93种材料苗期的RNA进行紫外分光光度计检测，检测后发现RNA样品的OD260/280均在1.8～2.0左右，纯度较高，如图1所示。

2.2  EfGRAS基因克隆

以cDNA为模板，根据编码区起始端、终止端序列设计的特异引物进行基因编码区PCR扩增，将PCR产物经1%琼脂糖TAE凝胶电泳，EfGRAS基因在1769 bp处显示出1条清晰条带（图2），与预期结果一致。

2.3  EfGRAS基因生物信息学分析

2.3.1  EfGRAS转录因子的氨基酸组成及理化性质分析  将测序结果在NCBI上进行ORF Finder分析，结果发现有12个大小不同的ORF，其中最长的一个ORF有一个起始密码子ATG，终止密码子TAG，编码547个氨基酸，CDS全长1644 bp（图3）。利用ProParam在线软件对该基因编码蛋白质的氨基酸序列进行基本性质的分析：该蛋白的分子式为C2645H4149N747O816S21，相对分子质量为60.14 kDa，由C、H、N、O、S 5种原子组成，共有8378个原子;该蛋白不稳定系数为54.85，脂肪系数为84.37，GRAVY值为?0.293，是一类不稳定蛋白。

2.3.2  EfGRAS蛋白亲疏水性及保守结构域  利用ProScale在线软件进行亲疏水性分析，标度值<0的区域比>0的较为密集（图4），结合GRAVY值，预测该蛋白为亲水蛋白;对EfGRAS基因编码蛋白进行保守结构域预测分析，该蛋白含有1个典型的GRAS结构域（图5）。

2.3.3  EfGRAS蛋白亚细胞定位及序列比对分析  使用ProtComp Version 9.0对EfGRRAS蛋白进行亚细胞定位分析，从分析结果可以看出，该蛋白位于细胞核的积分值为5.93（表3），从而可以推测该蛋白定位于细胞核内的可能性较大。利用Blastx分析，与EfGRAS蛋白序列相似性高的蛋白序列有高粱（Sorghum bicolor）（96.71%）、糜子（Panicum miliaceum）（93.60%）、狗尾草（Setaria italica）（93.24%）、玉米（Zea mays）（92.78%）、佛肚竹（Bambusa ventricosa）（83.36%）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）（81.67%）、水稻（Oryza sativa Japonica Group）（81.17%）、黄麻（Corchorus capsularis）（65.80%）、油棕（Elaeis guineensis）（65.29%），利用DNAMAN 6.0将EfGRAS基因进行同源蛋白比较，结果见图6。

2.3.4  EfGRAS蛋白进化树分析及结构分析  MEGA 7软件分析的结果显示，EfGRAS蛋白与高粱亲缘关系最近，其次是玉米（图7）。SOPMA软件分析结果表明，该蛋白由α-螺旋（alpha helix） （43.51%）、延伸主链（extended strand）（10.97%）、β-转角（beta turn）（4.39%）和无规则卷曲（random coil）（41.13%）构成，总的来看，EfGRAS蛋白主要的二级结构是α-螺旋和无规则卷曲。EfGRAS蛋白的三级结构预测如图8所示。

2.4  EfGRAS基因在干旱胁迫下的定量表达分析

从图9可看出，干旱胁迫处理下，EfGRAS基因不同材料中的表达量有显著性差异。受到干旱胁迫后，‘蔗茅99-2基因表达量相比于对照组上调约57.6倍，‘滇蔗01-58上调约27.4倍，‘崖城89-9上调倍数较低。受到干旱胁迫后经过实时荧光定量PCR发现基因表达量都呈现不同程度的递增，其中甘蔗野生种‘蔗茅99-2中的基因表达量前后增幅最大，其次是杂交种‘滇蔗01-58。

3  讨论

3.1  EfGRAS基因表达量分析

目前，关于GRAS蛋白的抗旱研究中，发现少数GRAS蛋白参与非生物应激反应。郭华军等[17]以拟南芥为试验材料，并通过生物信息学技术和全基因组芯片分析发现在渗透和干旱胁迫时有10个GRAS家族基因表达量显著上调，然后利用功能基因组平台，初步发现SCL13基因可能在应答过程中参與了ABA依赖型信号转导途径。李亚飞等[18]通过转录组数据分析了在热胁迫和干旱胁迫下小麦中GRAS基因的表达量的差异，发现该基因在响应干旱胁迫的过程中起着关键的作用。Xu等[19]探究了GRAS转录因子基因OsGRAS23的抗旱能力，结果表明过表达OsGRAS23的水稻植株与野生型水稻相比，具有更强的抗旱性和抗氧化能力。Ma等[20]为探究GRAS的抗旱性和耐盐性，从胡杨中分离出PeSCL7基因，研究发现PeSCL7基因在拟南芥中的过表达显示出提高了耐旱性和耐盐性。Czikkel等[21]研究发现NtGRAS1与烟草的抗旱性相关，在干旱胁迫下NtGRAS1表达被诱导。

研究表明，EfGRAS基因受到干旱胁迫后能被诱导，基因表达量均表现上调，但在‘蔗茅99-2‘崖城89-9‘滇蔗01-58中的上调倍数不同，其中在‘蔗茅99-2中EfGRAS基因上调倍数最大，本研究与前人研究结果基本一致，推测EfGRAS在参与蔗茅干旱胁迫响应过程中起正调控的作用。

3.2  EfGRAS转录因子抗旱性克隆分析

GRAS蛋白是一个多功能蛋白质，参与许多生物学过程，除参与植物的生长发育外，也已经鉴定发现多种GRAS转录因子具有抵抗不同非生物胁迫的功能。Li等[22]发现BrLAS编码一种胁迫反应的GRASs转录因子，该因子可正向调节干旱胁迫的耐受性。Liu等[23]以辣椒为试验材料发现，在冷害、干旱、盐和赤霉素（GA）处理下，有21种CaGRAS基因差异表达，表明它们可能与植物对非生物胁迫的反应有关。粟莉圆等[24]在热胁迫下，JrGRAS2基因被显著诱导，发现转JrGRAS2基因酵母表现出较对照更高的生存活性，表明JrGRAS2基因具有响应热胁迫的能力且能提高酵母的抗性，JrGRAS2基因可作为核桃逆境应答的重要候选基因。韩菲等[25]以“富士×特拉蒙”杂交后代柱型株系新梢为试材，用同源克隆方法，得到了柱型苹果GRAS基因家族的MdSCR基因。李阿英等[26]以拟南芥SCL6和杨树GRAS cDNA 序列作为模板，对柑橘EST数据库进行同源检索筛选出柑橘SCL6和GRAS基因的cDNA序列，并以枳花cDNA为模板，利用5 RACE和3 RACE技术获得枳的SCL6和GRAS cDNA全长，分别命名为Pt-SCL6和Pt-GRAS。

本研究结果可以推测出EfGRAS可能是一个抗旱基因，通过对蔗茅EfGRAS基因的克隆、生物信息学分析，确定该蛋白不稳定系数为54.85，脂肪系数为84.37，GRAVY值为?0.293，是一类不稳定蛋白，EfGRAS蛋白与高粱亲缘关系最近，主要的二级结构是α-螺旋和无规则卷曲，为进一步深入研究EfGRAS基因的功能奠定了基础。

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