利用便携式运输箱实现猪卵母细胞体外成熟

徐明珠，陶瑞鑫 ，贾超，牛培培，李娟*

(1. 南京农业大学动物科技学院，江苏 南京 210095；2. 淮安市南农大新农村发展研究有限公司，江苏 淮安 223005)

我国是养猪大国，不仅养猪数量和种猪市场世界第一，而且猪的遗传资源丰富[1]。卵母细胞体外成熟、体外胚胎生产以及胚胎移植是保存和传递优质资源的重要技术环节。采用合适的方法保存卵巢、运输卵巢和卵母细胞及可移植胚胎对于更好的利用资源尤为重要[2]。在实际生产中，受到运输距离、方式和温度变化等因素影响，最终从卵巢中采集的卵母细胞质量也会受到影响[3]，而卵母细胞的质量直接影响后续胚胎发育，极大地限制了卵巢资源的利用。若能提高母猪卵巢体外运输质量或使得卵母细胞在运输过程中实现体外成熟，将能更好的利用优质保种资源。目前，关于猪卵巢运输温度、运输时间对卵母细胞的体外成熟率、体外授精率、胚胎发育率的影响已有较多报道[4-6]，但少有研究对运输过程中卵母细胞能否实现体外成熟以及胚胎在运输箱中的发育效率进行报道。

胚胎移植是辅助生殖技术中最重要的环节之一[7]。辅助生殖过程中的多种因素决定其成功效率，其中就包括了胚胎的质量、植入前胚胎保存与运输方式、胚胎移植过程中受体母猪生理状况[8]以及胚胎运输容器等[9]。如果移植足够数量的优质胚胎，受体母猪将会获得更高的妊娠机会[10]。然而，体外生产所得胚胎均需置于恒温运输箱中运输到猪舍进行胚胎移植。通常实验室距离猪舍距离较远，长距离和长时间运输将影响最终用来移植的胚胎质量。因此，运输箱的设计若能在保持恒温的同时满足胚胎体外培养条件，则能够提高可用优质胚胎数量。因此，本研究旨在使用一种能够维持运输箱内温度恒定且满足各类型存放容器的便携式运输箱，并探究在运输箱中卵母细胞成熟效率和胚胎发育潜力。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

除另有说明外，所有试剂均购于Sigma公司(St. Louis, MO, USA)。

1.2 运输箱选择

选用如图1所示的便携式运输箱。其含两种类型插孔以容纳1.5 mL和0.5 mL离心管且中间部分设有凹槽用来固定0.25 mL麦管。

A.插孔与凹槽标记；B. 放入离心管与麦管

1.3 运输箱温度稳定性评估

运输箱外接电源后，每隔2 h用温度计读取运输箱内1.5 mL、0.5 mL离心管及0.25 mL麦管的温度，并分别记为1.5 mL T、0.5 mL T和0.25 mL T。运输箱未外接电源时，同样每隔2 h使用温度计读取箱内温度，直至电源耗尽，1.5 mL、0.5 mL离心管及0.25 mL麦管的温度分别记为1.5 mL T′、0.5 mL T′ 和0.25 mL T′。

1.4 卵母细胞成熟率及质量评估

从后备母猪卵巢中，采集具有良好形态特征的卵丘-卵母细胞复合物(COCs)，并在IVM培养基中进行体外成熟(TCM-199中添加10%庆大霉素、10%卵泡液、0.8 mmol/L L-谷氨酰胺、75 μg/mL青霉素、50 μg/mL硫酸链霉素、15 IU/mL孕马血清以及15 IU/mL人绒毛促性腺激素。所用COCs随机分为以下4组：A组(对照组)，四孔板每孔放入约60个COCs，置于38.5℃、5% CO2、20% O2的培养箱(Thermo Scientific, American)中连续培养42～44 h；B组，在1.5 mL离心管(Axygen, Mexico)中放入约60个COCs；C组和D组，分别在0.5 mL离心管(Axygen, Mexico)中放入约30个COCs、0.25 mL麦管中放入约20个COCs，置于38.5 ℃运输箱中进行体外培养42～44 h。

为进一步评估在运输箱中成熟的卵母细胞质量，将不同组别优质成熟卵母细胞进行孤雌激活(PA)生产胚胎。具体步骤如下：体外培养42～44 h后，用透明质酸酶(1 mg/mL)吹打去除卵丘细胞，统计卵母细胞死亡率、MII期成熟率。挑选已排出第一极体的成熟卵母细胞，在0.5 mm融合槽中使用0.86 kV/cm的单直流脉冲,持续80 μs电激活 (model 450, BTX, San Diego, CA, USA)，随后转移至含10 μg/mL放线菌酮(CHX)和5 μg/mL 细胞松弛素B (CB)的PZM-3培养基中，置于38.5 ℃、5% CO2、20% O2的培养箱内继续4 h化学激活。根据成熟卵母细胞来源，将所生产PA胚胎被分为4组，既A-A′，B-B′，C-C′，D-D′。激活的PA胚胎继续以其来源的卵母细胞对应的环境体外培养，分别于24 h和48 h统计其分裂率。因运输箱在未外接电源时，60～64 h电量耗尽，因此未能继续PA胚胎体外培养到囊胚期。

1.5 数据分析

试验数据采用SPSS软件(IBM SPSS Statistics 20.0)进行统计分析。通过卡方检验对数据进行差异性分析，P<0.05时差异显著，P>0.05时差异不显著。

2 结果

2.1 运输箱温度维持

如图2所示，无论运输箱是否外接电源，1.5 mL T与1.5 mL T′、0.5 mL T与0.5 mL T′、0.25 mL T与0.25mL T′ 之间温度无显著差异，温度均维持在38 ℃，且T与T′ 温差保持在±0.2 ℃内。而0.25 mL T与0.25 mL T′ 相对较低，维持在37.3 ℃。由图1可知，运输箱内1.5 mL、0.5 mL离心管及0.25 mL麦管放置结构不同，使得0.25 mL麦管与空气接触面积更大，这可能是导致0.25 mL麦管温度维持恒定但相对较低的原因。

图2 运输箱内温度变化情况

2.2 卵母细胞在运输箱中能够进行体外成熟

不同培养条件下COCs体外成熟44 h后卵丘细胞扩散情况如图3所示。B组和C组与A组相比，其卵丘细胞扩散表型一致。而D组卵丘细胞扩散相对较差。卵母细胞死亡率、MII期成熟率统计情况如表1所示，尽管D组卵丘细胞扩散情况不如其他组别好，但A，B，C和D组卵母细胞死亡率与成熟率均无显著差异。

选择含有第一极体且细胞膜完整，细胞质致密均匀的优质成熟卵母细胞(图4)，生产孤雌激活胚胎。各组胚胎发育能力如表2所示， B-B′组胚胎2-细胞分裂率显著高于C-C′和D-D′组，但4组胚胎继续发育到4-细胞阶段时分裂率无显著差异。

A.培养箱条件下，COCs置于四孔板中体外成熟；B. 运输箱条件下，COCs置于1.5 mL离心管中体外成熟；C. 运输箱条件下，COCs置于0.5 mL离心管中体外成熟；D. 运输箱条件下，COCs置于0.25 mL 麦管中体外成熟；E. 未成熟卵母细胞

图4 优质成熟卵母细胞

表1 运输箱中卵母细胞的体外成熟效率

表2 不同成熟条件下PA胚胎发育效率

3 讨论

无论以何种技术体外生产所得猪胚胎都需通过运输箱储存运送至猪舍后进行胚胎移植手术[11]。可移植胚胎质量很大程度受卵母细胞质量影响。成熟卵母细胞质量与早期胚胎发育能力密切相关，优质卵母细胞生产所得胚胎具有更高的发育潜力。影响猪卵母细胞核质成熟的因素除了成熟时间和使用的成熟培养基类型外，还包括培养湿度、气体组分和温度等微环境，其中温度是维持胞质正常成熟最重要的微环境因素[12-13]。母猪经超数排卵后回收所得的卵母细胞或屠宰场回收的卵巢均需要在短时间内运输到实验室以降低损伤[2,14]。在运输过程中卵母细胞的质量会受到培养基类型和体积、运输容器以及运输中温度的稳定性等因素的影响[15]。胚胎在液体环境中被运输直到移植到受体母猪体内的过程也需要维持一个相对稳定的微环境，而运输过程中温度稳定性是关键因素，不稳定的温度会影响移植前胚胎的质量[16]。如果在运输过程温度不断变化则会导致胚胎或卵母细胞后续发育异常甚至死亡[17]。已有研究报道，卵母细胞可在一种便携式培养箱中完成体外成熟[18]。我们的研究结果同样显示，运输箱在外接或不接电源情况下均能维持猪卵母细胞发育所需恒定温度，并且卵母细胞在运输箱中能够完成体外成熟，且成熟率与培养箱成熟率相比不存在显著差异。因此，运输箱可用于体外成熟培养卵母细胞且能够支持早期PA胚胎发育。

完全生长COCs外周包裹多层卵丘细胞，卵丘细胞通常被认为是卵母细胞胞质与卵泡液直接的屏障，但卵丘细胞可借助间隙连接通过透明带与卵母细胞发生联系，为卵母细胞发育提供所需营养物质[19-23]。卵母细胞体外成熟过程中，卵丘细胞的扩散程度常作为判断卵母细胞成熟及成熟质量的主要标准。本研究结果显示，各组卵丘细胞均正常扩散，且卵母细胞体外成熟率无显著差异。另外，猪卵母细胞中含有大量内源性脂，内源性脂是卵母细胞成熟过程中的重要能量来源[24-25]。已有研究表明，卵丘细胞与卵母细胞的互作[26]、内源性脂[27]以及PZM3[28]中的营养物质已足够促使卵母细胞发育成熟。但卵母细胞成熟和胚胎发育不仅所需要培养基中化学物质的支持以及各成分合适的比例，也需要考虑培养温度、气体组分等微环境因素对卵母细胞和胚胎质量的影响[29]。哺乳动物植入前胚胎对环境改变十分敏感，并且培养条件会直接影响其后续生长和发育潜力。因此，培养环境的物理条件对于胚胎质量同样至关重要。在研究中，尽管在运输箱中成熟的卵母细胞后续胚胎早期发育能力并未表现出显著缺陷，但在运输箱内体外成熟过程中一些分子机制的改变可能会对胚胎后续发育及其质量存在潜在影响[30-31]。在我们的研究中，无论是在培养箱还是在运输箱中培养，卵母细胞成熟液和胚胎培养基相同，并且在一定时间内运输箱可以保持相对稳定的温度供卵母细胞成熟和胚胎早期发育，但仍需考虑培养箱与运输箱之间存在气体含量、湿度等不可控差异，这些潜在的物理条件差异可能会导致卵母细胞和胚胎的质量的发育潜力存在差异。

综上所述，在温度维持稳定的运输箱中可实现卵丘卵母细胞复合体体外成熟，以及支持孤雌激活胚胎完成至少两次卵裂，且体外成熟效率以及4-细胞阶段卵裂率并未受到显著影响。