姜黄素光动力对牡蛎脂质氧化水解酶的影响

张 旭,卢 娜,李兆杰,薛 勇,袁诗涵,薛长湖,唐庆娟

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266000)

姜黄素光动力是一种新型广谱杀菌技术,在贝类加工中有着广泛的应用前景。前期研究表明,姜黄素光动力能够减缓牡蛎脂质氧化水解的进程[1]。酶是导致牡蛎脂质氧化水解的主要原因。

脂质的酶促氧化主要是由脂肪氧合酶(LOX)引起的,脂肪氧合酶是含非血红素铁的氧化还原酶,可以催化多不饱和脂肪酸(PUFA)发生的过氧化反应[2]。脂肪氧合酶可以作用在多不饱和脂肪酸的特定位点,通过分子内加氧,生成具有共轭双键的氢过氧化物,这些氢过氧化物又会分解为短链的醛、醇和碳氢化合物,产生不良气味[2]。Yarnpakdee等对罗非鱼在冷藏过程中的脂肪氧合酶活性进行了检测,研究表明脂肪氧合酶在罗非鱼脂质的氧化过程中起到了重要的作用[3]。Zhou等检测了脂肪氧合酶在贻贝冷藏过程中的活性变化,结果表明脂肪氧合酶与贻贝的脂质氧化密切相关[4]。

脂质的水解是脂肪酶及磷脂酶引起的,在冷藏过程中,这些酶仍保持着一定的活力[5]。脂肪酶是一类能够催化长链酰基甘油酯键水解的酶。磷脂酶有磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)四种类型,分别作用于磷脂不同位点[6]。牡蛎中甘油酯、磷脂会在脂肪水解酶和磷脂酶的作用下降解,产生大量游离脂肪酸。游离脂肪酸一方面继续分解产生小分子的醛和醇;另一方面,游离脂肪酸比甘油酯、磷脂更容易氧化,产生酸败气味[7]。Liu等研究证明,在低温冷藏过程中,脂肪酶对甘油三酯的水解起着重要的作用[8]。王昕岑对牡蛎中脂肪水解酶的活性进行检测,发现在冷藏过程中脂肪酶和磷脂酶依然保持着一定的活性,且与磷脂的水解密切相关[6]。

因此,检测姜黄素光动力对脂肪氧合酶、脂肪酶和磷脂酶的影响,对探究姜黄素光动力延缓牡蛎的脂质劣化具有较为重要的意义。这些引起脂质水解和氧化的酶,大部分是分布在牡蛎肌肉和内脏器官中的内源酶,还有一部分来自于牡蛎冷藏过程中由腐败菌产生的外源酶[9-11]。在实际检测过程中,牡蛎的内源酶和外源酶难以区别。为避免腐败菌产生的外源酶的影响,使牡蛎的体外酶活可以近似等于内源酶活性,本文提取了新鲜牡蛎中的脂肪氧化水解酶检测了内源酶的活性,并通过筛选产酶菌株、统计产酶菌株数量,确定姜黄素光动力对外源酶数量的影响,创新性地检测了牡蛎内源酶的活性,并从微生态影响外源酶的角度探究了姜黄素光动力对酶的影响,以期从酶的角度阐明姜黄素光动力减缓牡蛎脂质氧化水解的机理。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牡蛎 青岛团岛农贸市场,选购大小均匀,每个质量(250±10) g,30 min内运回实验室;姜黄素(食品添加剂级) 陕西慈缘生物科技有限公司;食品级乙醇(≥95%) 广西海盈酒精有限责任公司;海水素 广州益尔生物工程有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司;其他化学试剂 均为国产AR级普通试剂。

多功能光源仪 青岛建亮科技有限公司;JYL-C50T料理机 九阳股份有限公司;精密电子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司;Model 680 型酶标仪 美国Bio-Rad 公司;电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;超纯水系统 美国Millipore 公司;Anke台式高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 牡蛎分组及处理 根据牡蛎在10 μmol/L姜黄素的人工海水暂养3 h后,海水吸光值的变化得出每克牡蛎肉(包含内脏)的姜黄素添加量为0.0556 mg。将在未添加姜黄素的人工海水暂养3 h后的新鲜牡蛎在无菌条件下开壳,提取粗酶液进行如下分组处理:空白组:直接检测酶活;光动力组:向粗酶液中添加0.0556 mg/g牡蛎肉的姜黄素,置于420 nm光源下,能量密度7.2 J/cm2照射2 min,检测酶活。

1.2.2 脂肪氧化水解酶粗酶液提取

1.2.2.1 脂肪氧合酶粗酶液提取 按照参考文献[4]中方法进行,5 g牡蛎肉,加入15 mL 50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0,含1 mmol/L二硫苏糖醇和1 mmol/L乙二胺四乙酸)匀浆:25000 r/min均质4次,每次10 s,匀浆后在冰盒上搅拌30 min,4 ℃下15000×g离心1 h,上清液通过四层纱布过滤,收集滤液。

1.2.2.2 脂肪水解酶粗酶液提取 按照参考文献[5]中方法进行,2 g牡蛎肉,加入10 mL Tris-HCl(20 mmol/L Tris-HCl pH8,150 mmol/L NaCl pH8.5)缓冲液涡旋,5000 r/min均质2次,每次30 s,磁力振荡搅拌30 min,10000 r/min离心5 min,收集上清液。其中,脂肪酶,磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D均属于脂肪水解酶。

1.2.3 脂肪氧化水解酶活性检测

1.2.3.1 脂肪氧合酶活性测定 按照参考文献[12]中方法检测脂肪氧合酶活性,0.1 mL脂肪氧合酶粗酶提取液,加入2.9 mL 50 mmol/L柠檬酸缓冲液、预热的0.2 mL底物(140 mg亚油酸于5 mL含180 μL吐温20的去离子水中,调pH至9.0,定容至50 mL)。在30 ℃起始反应,准确计时,反应2 min后立即加入4 mol/L HCl至pH3.0,酸性条件下酶失去活性,反应终止,取适量体积的反应液于234 nm下测定吸光度。酶活定义:在此条件下每分钟增加0.001吸光度值定义为1 U。

1.2.3.2 脂肪酶活性测定 按照参考文献[6]中方法检测脂肪酶活性。底物溶液(3 mg/mL棕榈酸对硝基苯酚酯)与缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0))以体积比1∶9 (V/V)混合均匀,取1.5 mL上述混合液与0.5 mL粗酶提取液混合,涡旋后置于37 ℃反应10 min,加入2 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液,使酶失活,反应终止,再加入2 mL 0.5 mol/L 碳酸钠溶液显色,振荡后,在410 nm处测定吸光度值。脂肪酶水解对硝基苯酚酯产生对硝基苯酚,不同浓度的对硝基苯酚吸光度值不同,配制不同浓度的对硝基苯酚溶液,以浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标注曲线。根据标准曲线计算得到反应液中对硝基苯酚的浓度,酶活定义为在一定条件下,1 min内生成1 μmol对硝基苯酚所需的脂肪酶的量为1 U。

1.2.3.3 磷脂酶A1活性测定 按照参考文献[6]中方法进行检测磷脂酶A1活性。2.0 mL卵磷脂底物溶液(8%,用pH6.0的磷酸盐缓冲液配制)、2.5 mL Tris-HCl(10 mmol/L,pH8.5)和0.5 mL粗酶提取液混匀。于37 ℃反应15 min,加入1 mL 95%乙醇溶液,使酶失活,终止反应,混匀后加入3 mL异辛烷振荡。65 ℃静置分层,冷却至室温后,取上层溶液加入异辛烷,混匀后加入1 mL吡啶-铜盐显色剂(5%,pH6.1),涡旋后静置澄清,取上层有机相在714 nm处测定吸光度值。磷脂酶A1水解底物生成棕榈酸,不同浓度的棕榈酸与异辛烷和吡啶-铜盐混匀后吸光度值也不同。配制不同浓度的棕榈酸异辛烷溶液,加入吡啶-铜盐显色剂,以浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标注曲线。根据标准曲线计算得到反应液中棕榈酸的浓度,酶活力定义为在一定条件下,1 min内生成1 μmol棕榈酸所需的磷脂酶A1的量为1 U。

1.2.3.4 磷脂酶A2活性测定 按照参考文献[6]中方法进行检测磷脂酶活性。50 mmol/L Tris-HCl溶液(pH8.0,含有100 mmol/L NaCl,5 μg/mL牛血清白蛋白,5 mmol/L CaCl2,10 μmol/L 8-苯胺基-1-萘磺酸)170 μL和20 μL底物溶液(200 μmol/L的DMPC)混匀,26 ℃保温5 min后,加入10 μL粗酶提取液开始反应,荧光发射15 min观测其动力学曲线。吸收和发射波长分别为377和470 nm。磷脂酶A2的酶活力定义为在一定条件下,1 min内荧光强度改变1个单位定义为1 U。

1.2.3.5 磷脂酶C活性测定 按照参考文献[6]中方法进行检测磷脂酶C活性。2 mL的反应体系(0.25 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.2),60%山梨糖醇,10 mmol/L的底物对硝基磷酸胆碱)和100 μL的粗酶提取液混匀,于37 ℃水浴锅内反应30 min,加入1 mL 95%乙醇溶液,使酶失活,反应终止,测定溶液在410 nm处的吸光度值。磷脂酶C水解对硝基磷酸胆碱产生对硝基苯酚,不同浓度的对硝基苯酚吸光度值不同,配制不同浓度的对硝基苯酚溶液,以浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标注曲线。根据标准曲线计算得到反应液中对硝基苯酚的浓度,酶活定义为在一定条件下,1 min内生成1 μmol对硝基苯酚所需的磷脂酶C的量为1 U。

1.2.3.6 磷脂酶D活性测定 按照参考文献[6]中方法进行检测磷脂酶D活性。0.4 mL反应液与0.1 mL卵磷脂底物溶液(0.1 g 95% PC溶1 mL的乙醚,加入9 mL超纯水,超声得乳浊液)混匀,加入0.1 mL粗酶提取液,于37 ℃恒温水浴20 min,加入0.2 mL 50 mmol/L EDTA溶液,沸水浴5 min,使酶失活,反应终止,恢复至室温后,加入0.2 mL显色液,37 ℃下显色30 min,于500 nm下测其吸光值。磷脂酶D能够将卵磷脂水解成胆碱,不同浓度的胆碱呈现出不同的吸光度值,配制不同浓度的胆碱溶液,以浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标注曲线。根据标准曲线计算得到反应液中胆碱的浓度,酶活定义为在此条件下,1 min产生1 μmol胆碱所需要的酶量定义为1 U。

1.2.4 产外源酶菌株的筛选及菌种鉴定

1.2.4.1 菌株筛选 新鲜牡蛎肉1 g和9 mL无菌生理盐水在食品匀浆机中均质。将匀浆液按照1∶100、1∶1000、1∶10000比例梯度稀释后接种于不同的筛选培养基。37 ℃培养48 h后,查看平板阳性结果。筛选培养基配方如下:

产脂肪氧合酶菌株筛选培养基[13]:含有0.5%亚油酸和0.5%β-胡萝卜素的LB琼脂培养基。

产脂肪酶菌株筛选培养基[14]:橄榄油乳化液12 mL,中性红0.001 g,酵母膏0.1 g,琼脂1.5 g,海水100 mL(pH=7.2)。

产磷脂酶A1菌株筛选培养基[15]:卵磷脂2%,胰蛋白胨1%,NaCl 1%,酵母粉0.5%,溴甲酚紫3%,25 mol/L CaCl2(pH=7.0)。

产磷脂酶A2菌株筛选培养基[16-17]:含有2%卵磷脂的LB琼脂培养基(pH=7.8)。

产磷脂酶C菌株筛选培养基[18]:蛋白胨1%,NaCl 0.5%,牛肉膏0.3%,琼脂 2%,卵黄液2%(pH=7.2～7.4)。

产磷脂酶D菌株筛选培养基[19-20]:磷脂酰胆碱5.0 g/L,KNO35.0 g/L,K2HPO40.25 g/L,FeSO4·7H2O 0.005 g/L,琼脂20 g/L(pH=7.0～7.4)。

1.2.4.2 菌种鉴定 挑取平板上呈现阳性结果的单菌落,按天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取牡蛎体内细菌的DNA。以提取的DNA为模板,采用细菌通用引物27F-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG和1492R-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T扩增16S rDNA的全序列。PCR扩增体系(50 μL)为:Taq DNA聚合酶2.5 U,引物200 nmol/L,dNTP 200 nmol/L,60 mmol/L Tris-SO4,18 mmol/L(NH4)2SO4,2.0 mmol/L MgSO4,1%甘油,100 ng/μL牛血清蛋白,模板DNA 10 ng,补ddH2O至50 μL。扩增程序为:95 ℃预变性2 min;95 ℃变性30 s、60 ℃复性30 s、72 ℃延伸6 s、20个循环。委托生工生物工程(上海)股份有限公司对扩增后的序列进行检测。

1.2.5 菌株数量检测

1.2.5.1 牡蛎处理方式 牡蛎分为空白对照组和光动力组(每组5只),处理方式如下:

空白对照组(L-S-):人工海水中暂养3 h,贝水比为1∶4,无菌条件下开壳。

光动力组(L+S+):于姜黄素终浓度为10 μmol/L的人工海水中暂养3 h,贝水比为1∶4。无菌条件下开壳,420 nm光源照射(能量密度为7.2 J/cm2,照射2 min)。

每只牡蛎取1 g进行高通量测序、1 g进行细菌培养统计菌落总数。

1.2.5.2 Illumina MiSeq高通量测序 1 g牡蛎加入无菌生理盐水匀浆,按照细菌基因组DNA提取试剂盒提取牡蛎体内细菌的DNA。以提取的DNA为模板,采用细菌16S PCR引物341/357F-NNNNCCT ACGGGNGGCWGCAG和805/785R-GACTACHV GGGTATCTAATCC扩增16S rRNA的V1～V3高变区序列。扩增体系同1.2.4.2。

扩增后的产物委托北京奥维森基因科技有限公司进行高通量测序。使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建,构建好的文库用BioAnalyzer High-sensitivity DNA chip kit定量,文库合格后,使用Illumina Miseq对牡蛎微生物的V3～V4区进行上机测序,QIIMEv1.8.0用来分析16S rRNA基因序列,Mothurv.1.34.4用来进行数据分析。

1.2.5.3 菌落总数统计 1 g牡蛎肉和9 mL无菌生理盐水在食品匀浆机中均质。将匀浆液按照1∶100、1∶1000、1∶10000比例梯度稀释后接种于LB琼脂培养基。37 ℃培养48 h后,计数菌落形成单位。结果以lg(cfu/g)表示。

1.2.5.4 计算菌的数量 菌的数量=菌的相对丰度(%)×菌落总数(lg(cfu/g)),菌的相对丰度由1.2.5.2高通量测序结果分析得来,菌落总数由1.2.5.3中检测得来。

1.3 数据处理

每组实验做5个平行,运用Excel 进行数据分析与处理,采用SPSS 18.0软件中ANOVA分析进行数据统计与作图,数据以mean±SD表示。

2 结果与分析

2.1 姜黄素光动力对牡蛎内源性脂质酶活性的影响

空白组和光动力组的牡蛎脂质氧化水解酶的内源酶活性如图1所示。可以看出在牡蛎体内,脂肪氧合酶的活性最高,其次是磷脂酶A2、磷脂酶A1、磷脂酶D、脂肪酶和磷脂酶C,这与王昕岑[6]的研究结果是相似的。

图1 姜黄素光动力对牡蛎内源脂质氧化水解酶活性的影响

从图1A中可以看出,光动力组的脂肪氧合酶活性低于空白组,且其脂肪氧合酶的活性降低10%,说明姜黄素光动力可以在一定程度上降低内源性脂肪氧合酶的活性。姜黄素光动力能够使脂肪酶的活性从(0.04±0.01) U/g降低至(0.03±0.00)U/g,其脂肪酶活性极显著低于空白组(P<0.01),说明姜黄素光动力能够降低内源性脂肪酶的活性(图1B)。图1C中,姜黄素光动力处理能够使磷脂酶A1的活性降低约10%,其磷脂酶A1活性呈现出低于空白组的趋势(图1C),说明姜黄素光动力能够在一定程度上降低内源性磷脂酶A1的活性。光动力组的磷脂酶A2活性低于空白组约29%(图1D),说明姜黄素光动力处理能够在一定程度上降低内源性磷脂酶A2的活性。图1F显示,光动力组的磷脂酶D活性低于空白组约11%,说明姜黄素光动力处理在一定程度上能够降低内源性磷脂酶D的活性。

从图1E中磷脂酶C的活性变化可以看出,姜黄素光动力使磷脂酶C的活性略有升高,从(0.0039±0.003) U/g升高至(0.0046±0.005) U/g,这可能是因为姜黄素光动力处理后,磷脂酶C处于更加适宜的环境条件,使磷脂酶C的活性有小幅升高。王昕岑的研究表明,磷脂的水解主要与磷脂酶A2密切相关密切相关,而与其他磷脂水解酶的相关性较小[6],且在本文中,磷脂酶C活性最低,因此内源性磷脂酶C活性的小幅度提高对脂质水解影响较小。

表1 产脂肪酶菌株的测序及序列比对结果

综上所述,姜黄素光动力可以降低内源性脂肪酶、脂肪氧合酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D酶的活性,延缓牡蛎脂质的氧化和水解。

2.2 姜黄素光动力对牡蛎中产脂质酶菌株的影响

在筛选能够产生脂质氧化水解酶的菌株时,选择了新鲜牡蛎作为样品,发现仅在脂肪酶和磷脂酶C的筛选培养基上出现了阳性结果,没有筛选到能够产生脂肪氧合酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D的菌株,这说明在新鲜的牡蛎体内可能不存在产生脂肪氧合酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D的菌株。

2.2.1 产脂肪酶菌株的筛选及其在姜黄素光动力下的数量变化 在筛选产脂肪酶的培养基中含有中性红,中性红在中性环境下成黄色,酸性环境下成红色,菌株产生的脂肪酶可以将橄榄油水解为脂肪酸,使中性红呈现红色,因此,在产脂肪酶的菌株周围会产生红色的水解圈。在筛选牡蛎体内产脂肪酶菌株的过程中,筛选出了两株产脂肪酶的菌株(图2)。两株菌株在菌落形态上所不同,Lipase-1为白色菌落,菌落较小且凸起,边缘光滑,Lipase-2为白色菌落,菌落小且较为扁平,边缘光滑,经16S rRNA测序并在NCBI 序列比对鉴定,两株菌株均为假单胞菌(Pseudomonas)。

图2 产脂肪酶的菌株筛选结果

假单胞菌广泛存在于土壤和海水中,是一种无芽孢、有鞭毛、能运动的革兰氏阴性菌。假单胞菌是贝类腐败过程中的优势菌,这是因为它可以产生脂肪酶、蛋白酶等多种酶[21-22]。对假单胞菌产生脂肪酶的研究较为广泛,查代明等认为在所有微生物来源的脂肪酶中,假单胞菌产生的脂肪酶具有最好的性能[23],罗伟认为在低温条件下,假单胞菌更易产生脂肪酶[24],这与本文中的测序结果是吻合的。

根据16S rDNA测序数据分析,将假单胞菌的数量变化进行了统计(图3),发现姜黄素光动力处理极显著降低了假单胞菌的数量(P<0.01)。因此推测,姜黄素光动力一方面通过直接作用于牡蛎的内源性脂肪酶,并降低其活性,另一方面也可以减少分泌脂肪酶的菌数量,从而减少外源脂肪酶的量。

图3 姜黄素光动力对假单胞菌数量的影响

2.2.2 产磷脂酶C(PLC)菌株的筛选及其在姜黄素光动力下的数量变化 在筛选产磷脂酶C的培养基中,在产磷脂酶C的菌株周围会产生透明的水解圈。水解圈的形成是因为菌株产生的磷脂酶C会分解卵黄液中的卵磷脂。在筛选牡蛎体内产磷脂酶C菌株的过程中,筛选出了两株产磷脂酶C的菌株(图4)。两株菌株在菌落形态上所不同,PLC-1为白色菌落,菌落较大,中间凸起,边缘光滑,PLC-2为淡黄色菌落,圆形,边缘光滑,菌落中间隆起,经16S rRNA鉴定后,PLC-1为肠杆菌(Enterobacteriaceae),PLC-2为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas)。

图4 产磷脂酶C的菌株筛选结果

嗜麦芽寡养单胞菌是一种在养殖水体中普遍存在的菌类,是革兰氏阴性杆菌,两端钝圆,无荚膜,无芽孢[25-26]。肠杆菌是一类革兰氏阴性菌。Fox等从牛奶中分离产生磷脂酶C的菌株,发现有三株属于肠杆菌,这说明肠杆菌中的确存在可以产生磷脂酶C的菌株[27]。

根据16S rDNA测序数据分析,将肠杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌的数量变化进行了统计(图5),结果表明,姜黄素光动力极显著降低了这两种菌的数量(P<0.01)。因此,姜黄素光动力可以减少分泌磷脂酶C的菌数量,减少产酶量。

表2 产磷脂酶C菌株的测序及序列比对结果

图5 姜黄素光动力对肠杆菌(A)和嗜麦芽寡养单胞菌(B)数量的影响

综上所述,姜黄素光动力通过减少产酶菌株的数量,减少外源性脂肪酶和磷脂酶C的数量,延缓牡蛎脂质的劣化。

3 结论

姜黄素光动力能够通过降低牡蛎内源性脂肪氧合酶、脂肪酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D的活性延缓脂质劣化,也可以通过减少分泌脂肪酶的菌(假单胞菌)、分泌磷脂酶C的菌(肠杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌)数量,减少外源脂质酶的数量,来延缓牡蛎脂质的劣化。

本研究从酶的角度阐明了姜黄素光动力延缓牡蛎脂质氧化水解的机理,但脂质的水解和氧化可能并不仅仅是由于酶引起的,在后续实验中可以通过分析微生物组成,解析微生物与脂质劣化的关系,从多个角度阐明姜黄素光动力延缓脂质劣化的机理,为该技术在贝类保鲜中推广应用提供更加全面的理论依据。