磷酸鞘胺醇参与KkAy2型糖尿病小鼠胰腺纤维化发病机制探讨

修 磊，常 娜，姜 涛*

(1.首都医科大学附属北京世纪坛医院内分泌科，北京 100038； 2.首都医科大学基础医学院细胞生物学系，北京 100069)

磷酸鞘胺醇(sphingosine 1-phosphate，S1P) 是一种具有生物活性的分子，其对很多生理功能及病理过程都发挥着调控作用。鞘胺醇激酶(sphingosine kinase, SphK)是控制 S1P 合成的限速酶。大量的研究证据表明 S1P 参与多种疾病各种器官的纤维化发生，如肾纤维化，肝纤维化，心肌纤维化，肺纤维化及胰腺纤维化[1-4]。胰腺纤维化发生的特点为胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells, PSCs)活化成为肌成纤维细胞(myofibroblasts，MFs)，从而形成大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在胰腺内沉积，表现为平滑肌肌动蛋白α(α-smooth muscle actin, α-SMA)以及细胞外基质的主要成分I 型胶原 [collagen α1(I), Col α1(I)] 和 III 型胶原 [collagen α1(III), Col α1(III)]产生增加[5]。肌成纤维细胞来源广泛，多种因素导致胰腺损伤，胰腺星状细胞被激活，转化为肌成纤维细胞，表达平滑肌肌动蛋白 α，并在胰腺内产生胶原促进胰腺纤维化的发生[6]。在纤维化过程中，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)也发挥了很重要的作用，TGF-β1 是胶原产生过程中一种重要的介质，同时能够诱导多种细胞向肌成纤维细胞的分化[7-8]。

本研究试图探讨 SphK/S1P及TGF-β1在KkAy2型糖尿病小鼠胰腺星状细胞活化并产生胶原过程中的作用。这方面的研究将有助于我们更深入地了解糖尿病相关胰腺纤维化的发生机制，可能对糖尿病相关胰腺纤维化的预防及治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验中使用了SPF级雄性KkAy2型糖尿病小鼠和C57BL/6J对照小鼠各7只，日龄49～56 d，均体重18～22 g，均来源于中国医学科学院实验动物研究所[SCXK(京)2015-0004]。饲养于首都医科大学实验动物部SPF级动物房[SYXK(京)2015-0022]，单笼饲养。KkAy2型糖尿病小鼠给予高脂饮食(购自于中国医学科学院实验动物研究所)；C57BL/6J小鼠给予普通饲料。所有小鼠均自由进食、进水。实验动物质量符合实验要求，实验方案经首都医科大学实验动物管理和使用委员会审批，动物实验经过福利伦理审查(AEEI-2017-090)。上述动物的取材于首都医科大学实验动物科学部屏障动物实验设施进行。并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。实验中采集小鼠胰腺组织用于实时RT-PCR检测。

1.2 主要试剂与仪器

PCR试剂购买自加利福尼亚应用生物系统公司；其他常用试剂购买自美国西格玛奥德里奇公司。

1.3 实验方法

1.3.1 Real-time PCR

从新鲜的胰腺标本中提取总RNA使用的试剂盒购自德国 Qiagen 公司。我们的实验使用美国ABI Prism 7300序列检测系统进行实时RT-PCR检测。PCR相关试剂购自美国Applied Biosystems。引物序列见表1。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence list

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺星状细胞活化增加

既往的研究表明，胰腺星状细胞的活化在胰腺纤维化的发生发展中起着非常重要的作用[9]。本研究应用Real-time RT-PCR的方法检测KkAy2型糖尿病小鼠和C57对照小鼠胰腺中反映胰腺星状细胞活化的指标α-SMA的水平。结果显示：与对照组C57小鼠相比，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺高表达 α-SMA达5.3倍(表2、图 1)，这一结果表明与正常对照组小鼠相比，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺星状细胞活化增加。

注：C57对照小鼠和KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中Col α1(I)(图2A)和Col α1(III)(图2B)的mRNA表达水平比较。所有结果均在三个独立的实验中得到证实。与对照组相比，*P <0.05。图2 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中胶原表达水平明显高于对照组Note. mRNA expression of Col α1(I) (2A) and Col α1(III) (2B) in C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice. All results were confirmed in three independent experiments.Compared with vehide,*P<0.05.Figure 2 Collagen mRNA expression was up-regulated in KkAy type 2 diabetic mice

2.2 KKAy 2型糖尿病小鼠胰腺胶原表达增加

胰腺星状细胞活化后可产生大量细胞外基质在胰腺内沉积从而促进纤维化的发生，主要表现为细胞外基质的主要成分Col α1(I)和Col α1(III)产生增加。本研究应用Real-time RT-PCR的方法检测KkAy2型糖尿病小鼠和C57对照小鼠胰腺中细胞外基质的主要成分Col α1(I)和Col α1(III)的水平。结果表明与C57对照组相比，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中Col α1(I)和Col α1(III)的水平都明显增加，分别为对照组的7倍(图2A)和3倍(图2B)，这提示糖尿病会增加小鼠胰腺纤维化的发生。

表2 C57对照小鼠与KKAy 2型糖尿病小鼠 胰腺α-SMA表达Table 2 α-SMA mRNA expression in pancreas of C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice

2.3 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1及TGF-β1含量增加

有研究表明 S1P 参与了多种组织纤维化时肌成纤维细胞活化过程[10]。既往的研究表明，TGF-β1是胰腺星状细胞活化成为肌成纤维细胞的主要

注：C57对照小鼠和KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中α-SMA的mRNA表达水平对比。所有结果均在三个独立的实验中得到证实。与对照组相比，*P <0.05。图1 KKAy 2型糖尿病小鼠胰腺高表达α-SMANote. mRNA expression of α-SMA in pancreas of C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice. All results were confirmed in three independent experiments.*P< 0.05.Figure 1 α-SMA mRNA expression was up-regulated in pancreas of KkAy type 2 diabetic mice

刺激因素之一[11]。研究证实，TGF-β1能促进多种细胞，包括肝星状细胞、肺成纤维细胞、小鼠的骨髓间充质干细胞以及胰腺星状细胞向肌成纤维细胞分化[7]。本研究应用Real-time RT-PCR的方法检测KkAy2型糖尿病小鼠和C57对照小鼠胰腺中SphK1及TGF-β1的mRNA水平。结果表明，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1及TGF-β1含量分别为C57对照小鼠的2.6倍(图3A)及15倍(图 3B)，这提示，SphK1及TGF-β1可能参与了糖尿病相关胰腺纤维化的发生。

2.4 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1与TGF-β1水平呈明显正相关

我们之前的研究表明TGF-β1通过上调人肝肌成纤维细胞内SphK1的表达和活化，从而诱导胶原表达[12]。为了探讨KkAy2型糖尿病小鼠胰腺纤维化是否与TGF-β1诱导SphK1活化相关，我们对KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1与TGF-β1等指标的mRNA水平进行相关性分析。结果表明，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1与TGF-β1、α-SMA、Col α1(I)及Col α1(III)水平均呈明显正相关，结果有统计学意义(表 5)，这提示，TGF-β1与SphK1参与糖尿病相关胰腺纤维化的发生存在相关性。

3 讨论

胰腺纤维化常常是与慢性胰腺炎和胰腺癌相伴随的一种病理变化，可导致胰腺功能丧失。胰腺纤维化是胰腺癌的发病基础，胰腺癌由于其不易早期发现及无有效治疗方法成为恶性程度最高的肿瘤之一[13]。目前有大量的研究在寻找潜在有应用价值的胰腺纤维化标志物，但其敏感性和特异性并

注：C57对照小鼠和KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1(图3A)及TGF-β1(图3B)的mRNA表达水平比较。所有结果均在三个独立的实验中得到证实。与对照组相比，*P<0.05。图3 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1及TGF-β1表达水平明显高于C57小鼠对照组Note. mRNA expression of SphK1 (3A) and TGF-β1 (3B) in C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice. All results were confirmed in three independent experiments.Compared with vehide,*P<0.05.Figure 3 SphK1 and TGF-β1 mRNA expression were up-regulated in KkAy type 2 diabetic mice

表3 C57对照小鼠与KKAy 2型糖尿病小鼠胰腺胶原表达Table 3 Collagen mRNA expression in pancreas of C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice

表4 C57对照小鼠与KkAy 2型糖尿病 小鼠胰腺SphK1及TGF-β1表达Table 4 SphK1 and TGF-β1 mRNA expression in pancreas of C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice

表5 SphK1与TGF-β1等指标mRNA水平相关性分析Table 5 Correlation analysis between mRNA levels of SphK1 and TGF-β1

不理想，因此研究胰腺纤维化发生的机制并寻找靶点能够早期阻止或逆转胰腺纤维化甚至是胰腺癌的发生有着重要的价值和意义[13-15]。目前关于胰腺纤维化有大量的研究，但其发病机制尚不明确，有研究表明胰腺星状细胞的活化在胰腺纤维化的发生发展中起着非常重要的作用，活化的胰腺星状细胞可以通过Wnt/β-catenin信号通路以及Hedgehog信号通路介导胰腺癌的发生和发展[5]。胰腺星状细胞活化为肌成纤维细胞后表现为平滑肌肌动蛋白α以及I 型胶原和 III 型胶原水平增加[16-17]。我们的研究表明与正常对照组C57小鼠相比，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中α-SMA、Colα1(I) 及Colα1(III) 水平明显增加，这表明糖尿病小鼠胰腺星状细胞活化成为肌成纤维细胞，并产生大量的细胞外基质，从而促进胰腺纤维化的发生。与正常小鼠相比，糖尿病小鼠胰腺纤维化发生明显增加。为了探讨KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中胰腺星状细胞活化的机制，我们检测了胰腺中SphK1与TGF-β1的水平，结果表明糖尿病小鼠胰腺中SphK1与TGF-β1的水平均明显增加，并且二者呈明显正相关。上述结果提示SphK1与TGF-β1参与了胰腺星状细胞的活化及胰腺纤维化的发生。为了进一步明确S1P在糖尿病小鼠胰腺纤维化发生过程中的作用，我们接下来的研究会在体外培养小鼠胰腺星状细胞，通过给予SphK 的药理学抑制剂 DMS或者用 RNA 干扰的方法特异性沉默胰腺星状细胞中 SphK1 的表达，从而检测高糖诱导下胰腺星状细胞的活化及胶原水平的变化。此外，我们的实验发现KKAy2型糖尿病小鼠胰腺组织中TGF-β水平明显高于对照组，并且SphK1与TGF-β水平呈明显正相关，那么在糖尿病小鼠中是否因TGF-β水平升高进而诱导SphK1激活胰腺星状细胞进而促进胰腺纤维化的发生呢，这将在我们之后的实验进一步明确。

S1P 可以在细胞内作为第二信使直接发挥作用，也可通过 ATP 结合转运蛋白分泌到细胞外，与细胞膜上的S1P受体(S1P receptors，S1PRs)结合后激活不同的下游信号通路并诱导不同的生理及病理过程。有研究表明S1P参与了多种器官纤维化的发生发展过程，但其参与胰腺纤维化发生的机制目前仍不明确。胰腺纤维化发病的高危因素包括家族史、吸烟、肥胖、慢性胰腺炎以及糖尿病等[18-20]。目前有研究认为胰腺纤维化甚至是胰腺癌的高发与糖尿病发病率的增加呈相关性[21-23]。大约85%的胰腺纤维化患者患有糖耐量异常或糖尿病[24]。有学者认为糖尿病导致胰腺纤维化发生率增高与高血糖、高胰岛素血症及胰岛素抵抗相关[20, 24-25]，然而其机制目前仍不明确，需要进一步的研究。我们的研究已经证实，糖尿病小鼠胰腺中高表达SphK1，这提示S1P可能参与了糖尿病相关胰腺纤维化的发生，接下来的实验我们还将探讨S1P是通过与S1PRs结合参与胰腺纤维化的发生还是作为第二信使直接在细胞内发挥作用的。我们的实验已经表明，在糖尿病小鼠胰腺中SphK1、TGF-β1、胰腺星状细胞活化的标志物α-SMA以及反映细胞外基质水平的Colα1(I)及Colα1(III)水平都明显增加，S1P参与这一过程是否通过其受体发挥作用呢？是否为TGF-β1诱导SphK1激活从而促进胰腺星状细胞活化促进胶原产生呢？此外，在胰腺星状细胞活化过程中，是否还有其他调控因子参与了高糖诱导SphK1表达的过程？这些问题尚需进一步深入研究。

目前，仍然缺乏有效的治疗纤维化的方法。纤维组织一旦形成，很难修复成正常组织。因此，越来越多的研究致力于如何预防或减慢纤维化疾病发展及阻断纤维化之前上游生物学过程。大量的体外和体内实验表明，S1P及其信号通路参与了多种组织纤维化的发展。此外，S1P和相关的信号通路构成了复杂的信号网络，并具有许多信号通路，例如炎症，凋亡和自噬，并调节纤维化的发展[4]。但是，目前的研究尚未完全阐明S1P作用的机制和相关的纤维化信号传导途径，它们在不同器官和物种中的作用不同，需要进一步研究。此外，S1P的干预和相关的信号通路是与纤维化有关的疾病的潜在治疗方法，S1P也有望在将来成为纤维化疾病严重程度的有效生物标志物。