龟羚帕安丸合神经干细胞移植对帕金森病大鼠中脑黑质多巴胺转运体、转录因子4蛋白表达的影响※

常学辉,张良芝

(1.河南中医药大学第二临床医学院,河南 郑州450002;2.河南中医药大学,河南 郑州450046)

帕金森病(Parkinson＇s disease,PD)属于中医“颤证”“震颤”等范畴,是临床中老年人多见的一种神经系统变性疾病[1]。口服药物、外科手术治疗该病均有一定的局限性,目前潜力较大、临床应用前景较好的治疗策略之一是干细胞移植治疗[2]。但有学者研究发现,神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植后,PD患者症状虽然有一定的好转,但是移植后NSCs的存活率偏低,同时诱导多巴胺能神经元的转化分化率较低,最终使能发挥作用的多巴胺神经元的数量减少,不足以达到治疗的目的,使其治疗PD的长期疗效受限[3]。龟羚帕安丸是本院脑病科研制的用于治疗PD、PD综合征的中药复方,前期临床研究表明,龟羚帕安丸治疗PD临床疗效显著;前期动物实验研究表明,龟羚帕安丸具有明显的抗细胞凋亡的作用,具有诱导NSCs分化为成熟多巴胺能神经元的作用,并使之最终转化为DA,这可能是龟羚帕安丸治疗PD的机制之一[4-7]。本研究采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)立体定向注射法制备PD大鼠模型,观察NSCs定位移植联合龟羚帕安丸口服对PD模型大鼠中脑黑质多巴胺转运体(DAT)、转录因子-4(Brn-4)表达的影响,为其进一步临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 动物 SD大鼠,SPF级,体质量(200±20)g,雄性大鼠90只用于造模,另10只雌性大鼠及5只雄性大鼠用于神经干细胞制备。大鼠购于山西医科大学实验动物中心,动物许可证号为SCXK(晋)20150001。实验在河南省中医院中心实验室[SYXK(豫)2011-0002]进行,采用IVC大鼠独立通风系统,明暗交替各12 h进行光照,温度20～26℃,湿度40%～70%,适应性喂养1周。

1.2 药物及试剂 美多芭(多巴丝肼片,上海罗氏制药有限公司,规格:250 mg,批号:H10930198);龟羚帕安丸(河南省中医院院内制剂,郑卫制剂Z04010162,规格:60 g/瓶,批号:Z04010162);阿扑吗啡(APO,Sigma公司,批号:Z100839);6-羟基多巴胺(6-OHDA,Sigma公司,批号:S30042);4%水合氯醛(天津市光复精细化工研究所,批号:20160312);注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司,批号:F1306208);DMEM/F12培养基(Hy Clone,批号:SH30023．01);2%B27添加剂(Invitrogen,批号:17504-044);25%胰蛋白酶(上海基尔顿公司,批号:BYL409267);bFGF(NOVO,批号:C046);Brn-4检测试剂盒(Abcam公司,批号:ab104562);DAT检测试剂盒(武汉博士德,批号:A4131);SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒均购于武汉博士德有限公司,PBS缓冲液(批号ZM0013)购于中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 仪器 大鼠脑立体定向仪(Stoelting公司);高速颅骨钻(淮北正华生物仪器设备有限公司);5μL微量进样器(上海安亭微量进样器厂);Olympus光学显微镜。

2 方法

2.1 NSCs的培养与鉴定 根据文献制备:在SD大鼠动情期时按照2∶1的雌雄比例合笼,第2日早晨检查雌鼠阴道栓,并行阴道涂片,如发现阴道栓(表现为米粒大小、白色),或者阴道涂片在光学显微镜下发现精子者记为Ed 0.5,雌鼠常规饲养15 d[8]。颈椎脱臼法处死孕鼠,取出胚胎,摘取胎头,分离双侧海马组织,剪碎,使细胞液成为均匀悬浊液,制备NSCs,采用Nestin鉴定法,若Nestin阳性表达,提示其为神经干细胞。

2.2 药物制备 美多芭用0.9%氯化钠注射液稀释为2.0 mg/mL,现配现用。龟羚帕安丸研末,过120目筛,用0.9%氯化钠注射液分别稀释为0.4、0.2、0.1 mg/mL混悬液,4℃保存,备用。

2.3 PD大鼠模型制备 选用SPF级SD雄性大鼠,APO以0.5 mg/kg腹腔注射,选择未出现震颤、旋转等行为的大鼠,称重后用4%水合氯醛按照8 mL/kg腹腔注射麻醉;固定,头部备皮,消毒,手术刀沿头皮正中纵线切1个1～2 cm的切口,暴露前、后囟门。参照《大鼠脑立体定位谱图》,行脑立体定位[大鼠右侧中脑黑质致密部(SNC)坐标:距前囟中心后(A/P)4.6 mm,距前囟中心左右(L/R)1.7 mm,距脑膜表面深度(O/V)7.6 mm],定位后用牙科钻垂直钻孔,直至穿透SD大鼠颅骨;用微量取样器抽取6-OHDA溶液,按1 mm/min的速度缓慢进针,至预定深度后,以1μL/min的速度缓慢推入6-OHDA溶液,留针10 min。缓慢出针后常规缝合,10万单位青霉素肌内注射消毒,连续局部注射7 d。术后1周APO按0.5 mg/kg腹腔注射诱导大鼠旋转,如SD大鼠出现左侧逆时针旋转,并且在30 min内平均旋转圈数＞7 r/min,则视为PD大鼠模型建立[9]。

2.4 神经干细胞移植 标记F2代NSCs球神经干细胞Brdu[10],收集F3代的NSCs液体置于无菌离心管内,以1 000 rpm离心5 min;去上清,加入PBS,用气囊吹打成细胞密度为106个/m L的单细胞悬液。然后按照PD模型脑立体定向方法,选取右侧纹状体坐标(A/P 0.5 mm、L/R 3.0 mm、O/V 5.0 mm),用微量取液器抽取5μL NSCs悬液缓慢注射,其余步骤(备皮、定位、穿刺、术后缝合消毒等)与PD模型制作相同。

2.5 分组与给药方法 选择造模成功的PD模型大鼠60只,称重,按随机数字表法分为中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、美多芭组、NSCs移植对照组及空白对照组,每组10只。除空白对照组给予0.9%氯化钠注射液5μL注射外,其余各组均移植NSCs悬液5μL。中药高、中、低剂量组按照3.6、1.8、0.9 g/(kg·d－1)分别灌胃,美多芭组按照50 mg/(kg·d－1)灌胃,NSCs移植对照组和空白对照组予以等容积0.9%氯化钠注射液灌胃。每日灌胃2次,连续28 d。

2.6 DAT、Brn-4蛋白表达测定 末次灌胃后,每组动物均快速断头取脑,放置于冰盘,快速、完整地剥取脑组织,置于含0.1%DEPC的4%多聚甲醛中以4℃固定4～6 h后,分离中脑黑质。常规石蜡包埋,切片,每片厚度为5μm。采用免疫组化法检测各组大鼠中脑黑质DAT、Brn-4蛋白表达,具体按试剂盒方法操作。在光镜400倍视野下,每个切片随机选择5个视野,检测DAT、Brn-4蛋白表达数量,用平均积分光密度表示。石蜡制作、切片及指标检测均在郑州大学基础医学院完成,专人操作。

2.7 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件处理数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示,符合正态分布,且方差齐时,采用单因素方差分析;不符合正态分布,方差不齐时,采用多个相关样本的非参数检验分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

与空白对照组比较,各治疗组大鼠中脑黑质DAT、Brn-4蛋白表达显著增高(P＜0.05或P＜0.01)。与NSCs移植对照组比较,美多芭组及中药高、中剂量组DAT、Brn-4表达显著增高,中药低剂量组DAT表达显著增高(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠中脑黑质多巴胺转运体、转录因子4蛋白的表达水平(±s)

表1 各组大鼠中脑黑质多巴胺转运体、转录因子4蛋白的表达水平(±s)

注:与空白对照组比较,△P＜0.05,△△P＜0.01;与NSCs移植对照组比较,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01。

组别 只数 DAT表达水平 Brn-4表达水平中药高剂量组 10 113.58±14.06△△▲▲ 113.94±16.79△△▲▲中药中剂量组 10 147.43±15.84△△▲▲ 132.07±17.60△△▲▲中药低剂量组 10 83.43±17.16△△▲ 77.19±12.20△美多芭组 10 142.53±12.22△△▲▲ 96.14±19.71△△▲NSCs移植对照组 10 98.54±7.50△△ 71.21±18.11空白对照组 10 65.29±9.10 50.72±16.65

4 讨论

PD是中老年人的常见病、多发病,中医无PD病名,临床一般根据其症状归于“颤证”“振颤”等范畴。目前大多医家认为,PD病位在脑,为本虚标实之证,本多为肝肾失调,标多为风、痰、瘀互结。笔者依据肾-脑相关理论[11],结合多年临床经验,认为PD病位在脑,病理性质总属本虚标实,以肾精亏虚为本,以瘀风互结为标,因肾精亏虚,使脑髓受损、阴虚风动,加之瘀血阻络,蕴塞脑窍而发本病。PD治疗以滋补肝肾、化痰活血为法。龟羚帕安丸是河南省中医院自制的治疗PD的中药复方,主要由龟板胶、羚羊角粉、厚朴、全蝎、威灵仙等药物组成。方中龟板胶滋阴潜阳,补肾益血;羚羊角粉助龟板胶滋阴息风,止痉;全蝎祛风止痉通络,佐助羚羊角粉活血息风;威灵仙搜风通络,可以改善经脉拘挛状态;厚朴温中燥湿,消痰。诸药合用,共奏滋补肝肾、通络息风、养血活血之功,是治疗PD、PD综合征疗效显著的复方制剂。

DAT是位于中枢多巴胺能神经末梢突触前膜的糖蛋白分子,在多巴胺能神经元之间的信息传递过程中具有重要的作用,DAT能重新摄取已发挥生理作用的多巴胺(DA),调控突触间隙DA水平,并维系突触前DA的合成和储存,是控制脑内多巴胺水平的关键因素。脑内的DA发挥作用后不会被直接灭活,其可通过神经突触前膜上的多巴胺转运体返回神经元细胞,所以脑内DAT含量的多少可以间接反映体内黑质-纹状体通路DA能神经元的数量,DAT被当作DA能神经元的标志物[12]。Brn-4是转录因子POU蛋白家族第3类成员之一,研究表明,Brn-4在NSCs向神经元分化成熟过程中具有十分重要的作用[13]。本实验结果显示,美多芭组、中药各剂量组、NSCs移植对照组黑质DAT、Brn-4表达均显著高于空白对照组(P＜0.05或P＜0.01);美多芭组及中药高、中剂量组DAT、Brn-4表达显著高于NSCs移植对照(P＜0.05或P＜0.01)。上述结果表明,美多芭及龟羚帕安丸均有上调DAT、Brn-4表达的作用,且效果优于单纯神经干细胞移植。结合中医“补肾生髓”理论与Brn-4促进NSCs向神经元细胞转化,可以推测其作用机制可能与Brn-4能改善细胞微环境、释放细胞外来信号等作用有关。因此,龟羚帕安丸口服联合NSCs移植治疗PD模型大鼠后,可以通过检测PD大鼠中脑黑质Brn-4含量,推测“肾-脑相关”理论与神经干细胞-神经细胞的平行关系。

综上所述,龟羚帕安丸可能通过提高DAT、Brn-4蛋白的表达,促进NSCs向神经元分化及新生神经元转向成熟细胞,提高NSCs移植存活率,这可能是龟羚帕安丸治疗PD的作用机制之一。