普济煎液对豚鼠EB病毒的抑制及免疫干预作用

江伟炽，苏旭春，闫冰川，孔嘉欣，程 玲，宋 璟

（1.广州医科大学，广东 广州 511436；2.广州医科大学附属肿瘤医院中西医综合二科）

EB病毒感染可诱发鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、胃癌等多种肿瘤[1]。尤其在未分化型的鼻咽癌中，95%以上的患者感染EB病毒[2]。而且，EBV-DNA水平还与鼻咽癌治疗和预后密切相关[3]。因此治疗EB病毒感染，对鼻咽癌治疗具有重要意义。中药抗EB病毒感染具有独特优势，能有效抑制EBV-DNA复制，促进鼻咽癌康复[4]。本课题组曾采用普济煎液进行临床观察，证明普济煎液对鼻咽癌患者EB病毒有抑制作用[5]。为进一步探讨探究普济煎液抑制EB病毒增殖的作用机制，本研究建立豚鼠感染EBV模型，检测用药后豚鼠外周血单 个 核 细 胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMSc）中EBV-DNA拷贝数以及血清免疫因子含量变化。

1 材料

1.1 实验细胞

狨猴EBV转化的白细胞B95-8，由广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所提供。

1.2 实验动物

普通级FMMU雄性豚鼠，60只，体重240～280 g，购自南方医科大学动物实验中心，生产许可编号：SCXK（粤）2016-0041。

1.3 主要试剂

RPMI1640培养基、双抗、胎牛血清购自GIBCO公司；细胞DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；病毒DNA基因组提取试剂盒购自北京索莱宝公司；豚鼠外周血单个核细胞分离液购自天津灏洋（TBD）；EB病毒染料法荧光定量PCR试剂盒购自北京天恩泽有限公司；EB病毒早期抗原（EBV-VCA）抗体IgG ELISA试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司；豚鼠IL-10、IL-8 ELISA试剂盒购自江莱生物有限公司；豚鼠IL-6、TNF-αELISA试剂盒购自上海酶联生物有限公司；豚鼠IFN-γELISA试剂盒购自酶免有限公司。

1.4 主要药物

阿昔洛韦购自麦克林有限公司，产品批号A829547 25 g。普济煎液组方：牛蒡子15 g，女贞子15 g，夏枯草15 g，黄芩10 g，连翘10 g，柴胡10 g，陈皮5 g，射干10 g，僵蚕10 g，板蓝根30 g，猫爪草30 g，太子参10 g，玄参20 g，生地黄15 g，甘草5 g。实验用中药由广州医科大学附属肿瘤医院中药房提供，经自动煎药机煎煮。

1.5 主要实验仪器

Svnergyr2多功能酶标仪，美国BioTek公司；CFX96 Real-Time Systerm，美国BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 细胞培养

B95-8细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI1640培养基于37℃，4%CO2培养箱培养1周。当细胞计数达约5×106个/mL时，静置于33℃，4%CO2培养箱培养2周，于-80℃及37℃反复冻融3次，8 000×g离心30 min，取上清用0.45 μm滤器过滤，收集溶液于-80℃保存备用[6]。

2.2 EB病毒液病毒载量测定

取收集的EB病毒液，根据病毒DNA提取试剂盒说明书操作提取病毒DNA。使用EB病毒染料法荧光定量PCR试剂盒测定EB病毒载量，检测样品设置3个复孔取平均值，根据qPCR所得Ct值计算病毒载量。

2.3 动物模型建立及给药方法

将普通级豚鼠60只分成2组，分别为正常对照组10只，病毒组50只。所有豚鼠置于实验环境温度为20℃～22℃，12 h昼夜交替光照[7]，在动物房适应1周后，正常对照组经滴鼻、口腔接种100μL无血清RPMI1640培养基，病毒组接种100μL病毒液，计量为2.0×106病毒载量/只。接种1周后，局部麻醉，经股动脉取血5mL，分离外周血单个核细胞，检测EBV-DNA复制载量。正常对照组在取血过程中死亡1只，共有36只豚鼠造模成功。把动物分为模型组、阿昔洛韦组、低、高剂量普济煎液组各9只。阿昔洛韦组予阿昔洛韦组灌胃，普济煎液组予普济煎液灌胃，模型组和正常对照组分别予等比例生理盐水灌胃，给药1次/天，持续2周。阿昔洛韦组用药量为0.04 g/kg，低剂量普济煎液组为17.5 g/kg，高剂量组35 g/kg。末次给药后禁食12 h，使用10%水合氯醛腹腔注射过量麻醉后，剖胸心脏取血，一份使用柠檬酸钠抗凝管取血5 mL检测外周血单个核细胞中EB病毒复制载量，另一份使用离心管取血10 mL检测血清中免疫因子含量。

2.4 外周血单个核细胞EB病毒载量测定

取使用柠檬酸钠抗凝采血管采血样与等量分离液混合后，按照豚鼠外周血单个核细胞分离液说明书加入分离液中，500 g，离心30 min。离心后溶液分为四层，第一层为血浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为分离液层，第四层为红细胞层。用干净的15 mL离心管收集第二层细胞，加入10 mL清洗液，250 g，离心10 min。收集沉淀，用无血清RPMI1640培养基重悬细胞，按照细胞DNA提取试剂盒说明书提取DNA，并测定DNA浓度。根据北京天恩泽公司EB病毒染料法荧光定量PCR试剂盒说明书操作，测定外周血单个核细胞中EBV病毒载量。每个样本取3个复孔，反应条件为：预变性，95℃，2 min；PCR反应，温度91℃，15 s，58℃，60s，共45个循环。以6个阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线，再以待测阳品Ct值从标曲上找出其浓度的log值，计算出待测样品的DNA浓度。

2.5 ELISA指标检测

取无抗凝血样，室温放置2 h后，250 g离心5 min，小心收集上清于干净离心管中，根据豚鼠IL-10、IL-6、IL8、TNF-α、IFN-γ试剂盒以及EBV-VCA IgG试剂盒说明书进行检测，于450nm吸光度测定OD值，计算浓度值。

2.6 统计学处理

采用SPSS16.0进行分析，所有数据相互独立，以x±s表示，采用单因素方差分析法进行多样本比较，组间比较采用LSD检验，结果以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 绘制EB病毒液拷贝数的标准曲线

根据qPCR扩增结果，绘制标准曲线（见图1），检测EBV-DNA拷贝数标曲方程为y=-2.6909x+27.722，R2=0.999。根据病毒液qPCR的Ct值为9.554，计算出病毒DNA载量约为2.01×107copies/mL病毒载量。

3.2 豚鼠接种EB病毒1周后外周血单个核细胞中EB病毒拷贝数

把正常对照组编号为1～10，病毒组分为5组，分别编号A1-10、B1-10、C1-10、D1-10、E1-10，共有36只豚鼠检测到EBV-DNA复制，正常对照组在取血过程中死亡1只（见表1）。

表1 各组豚鼠接种EB病毒1周后外周血单个核细胞中EBV-DNA拷贝数

3.3 各组豚鼠体重变化比较

实验过程中，模型组豚鼠死亡2只。灌胃前1天、第7天，正常对照组，模型组、阿昔洛韦组、低、高剂量普济煎液组体重变化比较无统计学差异（P>0.05）。灌胃第14天，与模型组比较，正常对照组、阿昔洛韦组、低、高剂量普济煎液组豚鼠体重显著升高（P<0.05），高剂量普济煎液组体重较阿昔洛韦组升高（P<0.05）（见表2）。

表2 各组豚鼠灌胃前1天、灌胃第7天、灌胃第14天体重比较(g，）

表2 各组豚鼠灌胃前1天、灌胃第7天、灌胃第14天体重比较(g，）

注：与正常对照组比较，＊P>0.05；与模型组相比，＃P<0.05

组别正常对照组模型组阿昔洛韦组低剂量组高剂量组n/只灌胃第14天296.78±19.35＃271.57±11.39 297.25±20.38＃294.11±7.85＃317.78±20.28＃9 7 9 9 9灌胃前1天263.78±8.07 266.57±9.19＊265.12±9.18＊263.56±5.94＊261.44±8.27＊灌胃第7天269.67±9.06 273.14±5.15＊274.25±5.95＊270.78±8.38＊271.89±6.25＊

3.4 重新绘制EB病毒拷贝数的标准曲线

检测EB病毒DNA拷贝数标曲方程为y=-2.821x+27.544，R2=0.9978。利用新的标准曲线方程，根据样本的Ct值，计算灌胃2周后豚鼠外周血单个核细胞中EBV-DNA拷贝数变化（见图2）。

3.5 灌胃2周后各组豚鼠外周血单个核细胞中EBV-DNA拷贝数比较

与模型组比较，阿昔洛韦组、低、高剂量普济煎液组中EBV-DNA拷贝数降低（P<0.05）；与阿昔洛韦组比较，高剂量普济煎液组中EBV-DNA拷贝数降低（P<0.05）（见表3）。

表3 各组豚鼠EBV-DNA复制载量比较(1×104copies/μgDNA，)

表3 各组豚鼠EBV-DNA复制载量比较(1×104copies/μgDNA，)

注：与正常组比较，＊P<0.05，＃与模型组比较，＃P<0.05

EBV-DNA复制载量0.00±0.00 0.37±0.86＊0.25±0.16＊＃0.24±0.15＊＃0.22±0.11＊＃组别正常对照组模型组阿昔洛韦组低剂量组高剂量组n/只9 7 9 9 9

3.6 灌胃2周后各组豚鼠血清中EBV-VCA IgG、IL-10、IFN-γ含量比较

与正常对照组比较，模型组、阿昔洛韦组、低、高剂量普济煎液组中EBV-VCA IgG显著升高（P<0.05）；与模型组比较，阿昔洛韦组、低、高剂量组普济煎液组中IL-10含量降低（P<0.05），阿昔洛韦组、低、高剂量普济煎液组中IFN-γ含量显著升高（P<0.05）；与阿昔洛韦组比较，低、高剂量普济煎液组中IFN-γ含量升高（P<0.05）（见表4）。

表4 各组豚鼠血清中EBV-VCA IgG、IL-10、IFN-γ含量比较(pg/mL，)

表4 各组豚鼠血清中EBV-VCA IgG、IL-10、IFN-γ含量比较(pg/mL，)

注：与正常组比较，＊P<0.05；与模型组比较，＃P<0.05

组别正常对照组模型组阿昔洛韦组低剂量组高剂量组n/只IL-10 29.44±0.21 29.53±0.32 29.07±0.30＃29.07±0.33＃28.98±0.27＃9 7 9 9 9 EBV-VCA IgG 0.09±0.03 1.69±0.86＊1.63±0.13＊1.59±0.12＊1.64±0.97＊IFN-γ 55.45±1.33 52.37±3.16 57.73±1.38＃62.46±1.80＃63.59±1.25＃

3.7 灌胃2周后各组豚鼠血清中IL-6、IL-8、TNFα含量比较

与模型组比较，阿昔洛韦组、低、高剂量普济煎液组中IL-6、TNF-α含量显著升高（P<0.05）；阿昔洛韦组血清中IL-6含量与低、高剂量普济煎液组比较无统计学差异（P>0.05）；正常对照组、阿昔洛韦组、低、高剂量普济煎液组血清中IL-8含量比较无统计学差异（P>0.05）；高剂量普济煎液组中TNF-α含量较阿昔洛韦组显著升高（P<0.05）（见表5）。

表5 各组豚鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量比较(pg/mL，)

表5 各组豚鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量比较(pg/mL，)

注：与模型组比较，＊P<0.05；与阿昔洛韦组比较，＃P<0.05

组别正常对照组模型组阿昔洛韦组低剂量组高剂量组n/只9 7 9 9 9 IL-6 22.06±0.43 22.28±0.80 26.98±0.89＊27.06±1.07＊27.26±0.82＊IL-8 27.87±0.41 27.97±0.40 27.96±0.37 27.66±0.51 27.56±0.59 TNF-α 35.27±1.23 34.06±0.85 37.11±1.17＊37.90±0.65＊41.22±1.15＊＃

4 讨论

EB病毒在人群中具有普遍易感性，据统计，全球范围内共有90%以上的人感染EB病毒[8]。EB病毒感染多发生在幼儿时期，感染后多表现为隐性感染或者潜伏状态，一般无明显或伴随较弱的临床症状[9]。EB病毒作为一种致癌病毒，与鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、胃癌等多种恶性肿瘤发生有关，其中与鼻咽癌的发生、发展关系密切[10]。研究表明，在鼻咽癌患者治疗中，治疗后血清中EBVDNA水平持续增高，可增加鼻咽癌复发及转移风险[11]。因此，治疗EB病毒感染与鼻咽癌预后密切相关。

EB病毒主要感染B淋巴细胞及上皮细胞，诱导宿主产生固有免疫及特异性免疫应答，其中Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）介导的信号通路是固有免疫的重要信号通路[12]。TLRs表达于各种免疫细胞，通过诱导分泌肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、IL-6、IL-8细胞因子，同时上调NK细胞数量抵御病毒入侵[13]。BZLF1是EB病毒表达得即刻早期蛋白，在病毒感染早期，BALF1可下调TNF-α的表达，抑制机体抗病毒免疫反应，利于病毒DNA复制[14]。IL-6和IL-8都是一种多效能的细胞因子，可以刺激造血干细胞、免疫细胞等的增殖，调节机体抗炎反应，EB病毒编码的潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）能上调IL-6、IL-8和IL-10等细胞因子的表达，干扰宿主机体细胞因子分泌，从而调控免疫应答反应[15]。EBNA1是EB病毒核抗原的一种，可通过诱导IL-10产生抑制TLR信号通路激活，抑制抗原呈递细胞活性，产生免疫逃逸。细胞免疫在在抗EB病毒感染过程中亦占有重要作用，EB病毒感染机体后，EB病毒抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）大量增值，激活CD8+T细胞、CD4+T细胞介导的细胞免疫，同时CTL可分泌大量的IFN-γ进一步发挥抗病毒作用。EB病毒可通过干扰抗原呈递、干扰细胞因子作用，逃避宿主免疫，通过调节免疫抑制性因子IL-10，抑制IFN-γ细胞因子分泌，同时下调NK细胞和特异性CTL活力，调控TNF-α、IL-6、IL-8等细胞因子的分泌影响宿主免疫应答。

中医学认为EB病毒属于温病邪气，外感温邪，传变迅速，可侵及他脏。据临床研究显示，采用益气养阴结合清热解毒法，辩证用药，可提高中药治疗EB病毒感染的疗效。放疗是鼻咽癌的主要治疗手段，中医学认为放射线属于“火热”毒邪，耗伤气阴，故在使用中药治疗鼻咽癌合并EB病毒感染的患者时，不仅考虑采用清热解毒药物，也需配伍养阴清热中药，提高中药抗病毒疗效。普济煎液采用普济消毒饮为基础化裁，配伍太子参、女贞子、玄参、生地黄益气养阴药物，扶正祛邪并重。方中黄芩、板蓝根、牛蒡子、射干共为君药，清热解毒，利咽喉；僵蚕、猫爪草、夏枯草共为臣药，有解毒散结、化痰软坚之功效；陈皮、太子参、女贞子、玄参、生地黄为佐药，其中陈皮理气化痰，太子参、女贞子、玄参、生地黄益气养阴；甘草为使药，调和诸药。全方配伍攻补结合，共奏解毒化痰、益气养阴之功。

本实验通过滴鼻、口腔接种EB病毒成功建立豚鼠感染EB病毒模型[23]，接种1周后通过股静脉取血，分离外周血单个核细胞，并检测到36只豚鼠细胞中有EB病毒复制，说明造模成功。予阿昔洛韦、普济煎液灌胃2周后，与正常对照组比较，模型组、阿昔洛韦组、低、高剂量普济煎液组中EBV-VCA IgG含量、外周血单个核细胞中EBV-DNA拷贝数升高。与模型组比较，阿昔洛韦组、低、高剂量普济煎液组EBV-DNA拷贝数降低；高剂量普济煎液组EBV-DNA拷贝数较阿昔洛韦组降低，提示阿昔洛韦、普济煎液能有效抑制EBV-DNA复制。实验发现各组豚鼠血清中IL-8含量比较无明显差异，考虑普济煎液可能不通过调节IL-8的分泌抑制EB病毒增殖。与模型组比较，阿昔洛韦组、低、高剂量普济煎液组血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ含量升高，IL-10含量降低；高剂量普济煎液组中TNF-α、IFN-γ含量较阿昔洛韦组升高，提示普济煎液抑制EBV-DNA复制的机制可能是通过增加IL-6、TNF-α、IFN-γ的表达，降低血清中IL-10的表达，增强豚鼠免疫应答效应，抑制EB病毒增殖。