温运颗粒对婴幼儿脾虚泻粪便短链脂肪酸的代谢调控 *

徐珊,林丽丽,汪受传,

(1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；2.江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室，江苏 南京 210023)

腹泻是婴幼儿常见的消化系统疾病之一，脾虚证是其常见证型[1]。现代医学治疗多以肠黏膜保护剂[2]、微生态制剂[3]、纠正脱水及其他对症治疗为主。温运颗粒为全国名中医汪受传教授基于50年临床实践总结的儿童脾虚泻中医临床验方，疗效确切[4]。

代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，是对代谢产物变化及其揭示生物体生命活动代谢性质的系统科学研究。粪便中代谢产物主要包括人体内源性代谢物、肠道菌群代谢物及其他化合物[5]。

本研究采用气相色谱与质谱联用技术(GC-MS)技术，以粪便样本为例，分析了婴幼儿脾虚泻经温运颗粒干预前后粪便短链脂肪酸(SCFAs)的代谢变化，为进一步探讨温运颗粒治疗婴幼儿脾虚泻可能的干预机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

腹泻病例来源于2015年1月至2017年6月期间南京中医药大学附属医院名医堂，符合儿童腹泻疾病诊断标准[6]，且符合脾虚泻证候诊断标准[7]，共30例。其中男孩21人，女孩9人。对照组来自健康体检儿童30例，其中男孩19人，女孩11人。2组纳入年龄均为出生后3个月至3岁。临床资料见表1。2组在月龄、性别、身体质量指数(BMI)、喂养方式方面无统计学差异，具有可比性(P>0.05)。2组在采样当日粪便次数、粪便颜色、粪便性状方面有统计学差异(P<0.05)，腹泻组符合迁延性腹泻患儿粪便的特征。伴有不同程度脱水等严重合并症者；有明确先天/后天遗传代谢障碍疾病者；合并心血管、肝肾系统、血液系统、神经系统等其他原发疾病的患儿均不符合纳入标准。本研究经江苏省中医院伦理委员会批准(批号：2014NL-090-02)，所有患儿在纳入研究前，均由其监护人签署了知情同意书。

表1 2组一般情况比较

1.2 方法

1.2.1 设备与试剂 Trace 1310气相色谱、AS1310自动进样器、TSQ 8000质谱仪、TG-5MS气相色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)、Speed Vac离心浓缩仪均购置于美国Thermo公司；Allegra 64R离心机(Beckman Coulter，美国)；CPA225D电子天平(Sartorius，德国)；Synergy型超纯水系统(Millpore，美国)；BGZ-140型真空干燥箱(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)；Allegra 64R型涡旋振荡器(Scientific Industries，美国)。

氢氧化钠(西陇科学股份有限公司，批号：160705)；1-丙醇(北京百灵威有限公司，批号：LR30O43)；氯甲酸正丙酯(北京百灵威有限公司，批号：NCBKO-AF)；己酸、吡啶(99%，Sigma，美国)；正己烷(97%，Sigma，美国)。

对照品：异丁酸(99%)、异戊酸(99%)、戊酸(98%)均购于东京化成工业株式会社；庚酸(98%)、丁酸(99%)均购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；丙酸(98.3%，Dr.Ehrenstorfer，德国)；乙酸(99%，Sigma，美国)。

1.2.2 分组与给药 选取年龄3个月至3岁儿童，分为2组，其中30例脾虚泻患儿为腹泻组，30例健康儿作为对照组。

腹泻组给予温运颗粒口服。疗程为1周。温运颗粒(由江苏江阴天江药业有限公司生产的配方颗粒)组成为苍术6 g，煨益智仁6 g，砂仁1.5 g，炮姜3 g，茯苓6 g，炒麦芽12 g。服用方法：3个月～2岁，每剂均分6份，每次服1份，一日3次；2岁～3岁，每剂均分3份，每次服1份，一日3次。

1.2.3 样本采集 采集纳入研究的患儿治疗前后的粪便各2 g，对照组健康儿童粪便2 g，于-80 ℃保存，避免反复冻融。

1.2.4 检测粪便SCFAs样本前处理 称取50 mg粪便，加入1 000 μL 0.005 mol/L的NaOH水溶液(含5 μg内标己酸-d3)，涡旋10 min后，4 ℃离心(15 000 r/min)20 min，取500 μL上清加入10 mL玻璃离心管中，再加入300 μL纯水，涡旋30 s，混匀[8]。

向上述提取液加入500 μL丙醇吡啶溶液(3∶2，v/v)和100 μL氯甲酸正丙酯。涡旋10 s，超声1 min。衍生化后，使用正己烷萃取衍生化物质，首先向反应体系加入300 μL正己烷，涡旋1 min后，3 000 r/min离心5 min。取200 μL上层正己烷萃取液于进样瓶中。再次向反应体系中加入200 μL正己烷，涡旋1 min后，3 000 r/min离心5 min。再次取200 μL上层正己烷萃取液于进样瓶中。2次萃取液混合并离心后，取上清60 μL用于GC-MS/MS分析[8-9]。

1.2.5 检测粪便SCFAs色谱和质谱分析条件 载气为氦气，流速为1.2 mL/min，采用分流模式，进样口温度为260 ℃，分流比为10∶1，升温程序：起始温度50 ℃，保持2 min后，以10 ℃/min速率升至70 ℃后，然后以3 ℃/min速率升至85 ℃，再以5 ℃/min速率升至110 ℃后，然后以30 ℃/min速率升至290 ℃后保持8 min；进样量为1 μL。采用EI源，离子源温度为230 ℃，离子传输线温度为290 ℃，电离能为70 eV，m/z采集范围为30～600[8,10]。

2 结果

2.1 总离子流图

对照组，腹泻组治疗前、后3组粪便样本随机选择各1例。总离子流图如图1。从图中可见，各组在色谱峰数量、种类及峰高均存在一定差异，推测3组粪便中的SCFAs存在一定差异。

2.2 SCFAs检测结果

通过提取SCFAs及内标的峰面积检测各组中SCFAs的水平，结果表明：与对照组比较，腹泻组治疗前粪便中的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸水平显著降低(P<0.05)；与治疗前比较，脾虚泻儿童治疗后粪便中的丁酸、异丁酸、异戊酸水平显著升高(P<0.01)。见图2。

3 讨论

SCFAs是由1～6个碳原子组成的有机脂肪酸，包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、异戊酸等[11]，是肠道细菌发酵未消化碳水化合物的主要产物，也是蛋白质降解和氨基酸发酵的主要产物，是肠道菌群代谢产物中最主要的标志物之一[12-14]。研究发现菌群失调动物模型中SCFAs显著减少[15]。SCFAs的代谢活动，可能是肠道细菌与宿主间相互作用最重要的体现，乙酸、丙酸、丁酸是肠道SCFAs的主要组成部分，三者约占SCFAs总量的90%～95%[16]。其中丁酸是肠道所有发酵产物中最重要的一种，是结肠、盲肠上皮细胞最重要的能量来源[17-18]。

目前关于SCFAs的功能有以下方面：①SCFAs可促进肠黏膜细胞生长，维持肠黏膜形态。刁慧[19]研究表明，在猪回肠末端灌注不同浓度的SCFAs，肠道pH下降，有效抑制了肠上皮细胞凋亡。②SCFAs可通过激活G蛋白偶联受体[20-21]以及抑制组蛋白去乙酰化酶[22-23]，发挥肠道免疫调节功能[24-25]。比如乙酸盐和丙酸盐通过诱导T细胞分化为Treg，而丁酸盐通过GPCRs激活途径活化结肠内免疫细胞(如巨噬细胞)发挥免疫调节功能。③研究还发现SCFAs有维持水电解质平衡、抗病原微生物、改善肠道功能等重要作用[26-27]。

SCFAs测定结果显示，脾虚泻患儿粪便中的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸的水平较对照组明显降低，提示脾虚泻存在肠道菌群失调、肠道功能紊乱、肠道黏膜免疫失衡等情况。与正常儿相比，温运颗粒能显著提高脾虚泻患儿肠道内丁酸、异丁酸、异戊酸水平。据此推测温运颗粒发挥温阳运脾止泻功效的作用机制可能与调节肠道菌群平衡和肠道免疫，改善肠道内环境有关，其内在机制值得进一步深入研究。此结果与课题组同期开展的动物实验研究结果相一致[8]。