基于中医手法镇痛探讨大鼠腰痛模型的选择及应用进展

吕智桢，孔令军，姚重界，郭光昕，周鑫，张帅攀，房敏

(1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437；2.上海市中医药研究院推拿研究所，上海 200437；3.上海中医药大学针灸推拿学院，上海 201203)

腰痛(Low back pain, LBP)是腰部疾病中常见的临床症状之一，疼痛部位包含腰部、腰骶部、骶髂或臀部[1]。据相关研究显示，25～60岁工作的人一生中至少有一次不同程度腰痛的经历[2]。由于腰痛迁延难愈，据调查大约有5%～10%的腰痛患病人群会逐渐发展成慢性下腰痛(Chronic low back pain, CLBP)。这将增加患者的身心负担，并耗费巨大的医疗资金，成为棘手的社会健康问题[3]。随着目前人类生活方式的转变，退行性脊柱病已成为当今社会高发的慢性疾病，并与LBP密切相关。其主要症状“功能障碍与疼痛”几乎波及中老年人群，且发病年轻化趋势迅猛[4]。LBP属中医学“腰痛”范畴，外邪侵袭、气滞血瘀、肾亏体虚为其主要病因病机。现代临床对于腰痛有手术、口服药物、局部神经阻滞、运动疗法、物理治疗等多种解决方法，但手术治疗费用较高，而药物的毒副作用在临床中比较常见[5]。近年来，中医手法在临床镇痛显示出独特的优势，通过动物实验揭示了其镇痛效应[6]。但一个规范化、有逻辑性的动物实验，离不开合理的实验模型制备。本文就中医手法镇痛研究常用的LBP动物模型，结合目前手法镇痛的机制综述如下。

1 手法镇痛实验LBP模型的动物选择

近年来开展了较多的中医手法镇痛的基础研究，用于建立LBP的动物模型有很多，诸多学者使用过山羊、猪、狗、大鼠、小鼠等多种动物[7]。笔者认为以上动物中大鼠是较适用于中医手法镇痛研究的理想动物。首先，大鼠取材方便，检测范围广泛，可普遍用于建立各种病证模型；其次，由于镇痛实验离不开行为学指标，大鼠或小鼠相对于大型哺乳动物而言更有利于痛行为学等指标检测，以及后续实验的开展；再者，目前对于LBP的实验研究开展迅速，动物需求量大，大型动物如山羊因为其经济性稍差，用于大样本的基础研究普适性并不理想。大鼠轻便价廉，是实验动物的良好选择。最后，目前中医手法实验模拟仪的研制也运用到实验研究中，大鼠在实验中较大型动物能体现较好依从性，较小鼠肌肉部位更丰富，更易操作。基于以上分析，本文主要叙述基于中医手法镇痛研究较为适用的常见大鼠LBP模型。

2 大鼠LBP模型建立与评价

2.1 神经病理性疼痛相关模型

神经病理性疼痛(Neuropathic pain, NPP)是外周或中枢神经系统病变引起的疼痛，周围神经损伤是常见的引起NPP的病因之一。NPP发病机制尚不明确，呈高发病率，一直是医药领域的研究热点[8]。基于NPP的动物实验研究可为中医手法镇痛提供新的证据。CCD模型、SNL模型是中医手法镇痛研究中最常用的NPP动物模型。

2.1.1 慢性压迫背根神经节模型(Chronic compression of the dorsal rootganglion, CCD) 该模型在1998年由Hu[9]首次报道。该造模方法是在大鼠深度麻醉后，剔除大鼠背部的毛并局部碘伏消毒，垂直切开L4～L6皮肤并分离右侧脊旁肌肉，暴露右侧L4～L5、L5～L6椎间孔，然后将1根长4 mm、直径0.4 mm的无菌L型不锈钢棒，与脊柱背部正中线成30°、与脊柱背部侧面中线成10°的角度插入右侧L4～L5、L5～L6椎间孔；观察大鼠右侧后肢是否发生轻微的抽动，如发生则表明不锈钢棒对背根神经节(Dorsal root ganglion, DRG)造成卡压，遂逐层缝合肌肉及皮肤。经证明该模型能诱导出持续的大约30 d左右的触诱发痛和痛觉过敏[10]。腰椎间盘突出症(Lumbar disc herniation, LDH)是中医手法治疗的常见病之一，CCD模型可以直接压迫刺激背根节神经元胞体继发炎症，保留了外周初级传递功能，与腰椎间盘突出症引起腰腿痛的病理过程非常接近。模型手术简单，创伤小，无需打开椎管及暴露脊髓，降低感染风险，大鼠成活率高，致痛效果可靠，是目前研究腰椎间盘突出症所引起的神经病理痛比较理想的一种动物模型。林志刚等[11]发现推拿能够对CCD大鼠发挥镇痛效应。并发现与空白组、假手术组相比，模型组大鼠DRG神经元P2X3受体含量明显升高(P<0.001)，手法治疗后P2X3受体含量较模型组降低(P<0.05)。这可能是推拿手法发挥镇痛效应的关键靶点之一。Song等[12]研究发现用轻手法按揉CCD造模大鼠L4、L5 DRG支配的腓肠肌后，机械足反射阈值(Paw withdrawal threshold, PWT)和热缩足反射潜伏期(Paw withdrawal latency, PWL)均有不同程度的上升，且Piezo2机械敏感性离子通道在手法干预后下调(P<0.05)。这可能是推拿按揉法对CCD大鼠镇痛效应的潜在机制之一。

2.1.2 脊神经根结扎模型(Spinal nerve ligation, SNL) SNL模型是慢性压迫性损伤模型(Chronic constriction injury, CCI)基础上发展而来[13]。CCI模型[14]是通过使用3～4根铬制羊肠线结扎坐骨神经干中段，对坐骨神经造成持续性压榨性损伤，是一种神经病理痛和炎性痛相复合的疼痛模型。CCI模型羊肠线对神经压迫不能过紧，以免挤压伴行血管促使组织坏死，也不能过于宽松，否则达不到压迫的效果，松紧程度由施术者主观定夺，因此影响较大，易造成造模后动物行为学个体差异较大的结果。为了更好地实行神经结扎类型的模型客观化，SNL模型是较理想的脊柱病神经病理痛模型之一。该模型是在动物L4～L6处逐步分离筋膜和肌肉组织后，用5-0丝线紧扎一侧L5脊神经[15]。术后动物可出现长达6个月的痛觉过敏和冷刺激疼痛。同时动物有自发痛、跛行现象且不伴发自噬。SNL可以模拟腰椎病根性痛产生的病理改变[16]。由于对上一节段L4脊神经压榨容易导致运动功能障碍，下一节段L6脊神经位置不理想，实验操作不易。所以该模型准确定位至L5脊神经，SNL采用的是紧扎脊神经，较CCI而言更易量化，尽可能排除了主观性误差[17]。有研究发现对SNL大鼠每日1次，连续7 d的推拿手法模拟仪干预可以缓解神经病理性疼痛，其镇痛机制可能与上调自噬，抑制炎症反应有关[18]。

2.2 慢性炎性痛相关模型

慢性炎性痛一般是由创伤、化学刺激、感染或外科手术等所诱发的疼痛。组织损伤会导致大量的如COX-2、TNF-α、IL-1β等炎症介质释放，由于炎症级联反应的存在，脊神经元兴奋性、感觉神经元表型以及神经组织中的伤害性感受器的敏感程度等综合性因素改变会使机体反映出超敏性。因此在某些情况下，炎症或损伤状态在经过一定时间后会缓解，但是疼痛的感觉仍然会存在许久[19]，因此炎性痛呈慢行趋势较多。常用慢性炎性痛模型有ELFS和佐剂注射模型。

2.2.1 外部连接固定系统模型(External link fixation system, ELFS) Charles等[20]采用外部连接固定系统诱导了一种“亚脱位”模型。外部连接固定系统包括棘突附着部件(Spinous attachment units, SAU)和外部连接部件(External link units, ELU)，分别由3对棘突钢板、2块连接钢板及其相应的固定部件组成。实验大鼠L4、L5、L6棘突分别由SAU夹持固定，体外部分由ELU将其横向相互连接。依次将其安装在L4～L5之间和L5～L6之间，并用相应的螺钉固定。“亚脱位”模型是一种长期存活模型，可用于各种干预的观察。该模型已拥有一定的检测基础(生物力学、影像学、神经生物学、组织病理学等)，操作简单易重复，成功率高，并且ELFS部件可重复利用，符合卫生经济学观点。因此，该模型已受到越来越多国内外学者的关注。既往研究表明脊柱椎间小关节关节囊拥有来自同节段及上节段的背根节分支神经分布，进而导致脊柱相应节段功能障碍[21]。有研究发现ELFS模型成模后不同时期可见尼氏小体的动态变化，说明该模型诱导的大鼠腰椎亚脱位模型的微小结构变化可导致其相应神经系统病变[22]。ELFS手术需要剥离大鼠棘突旁竖脊肌，有一定创伤，因此在术后需给予单笼饲养，防止动物撕咬对方的外部固件，引起继发性感染，有一定死亡率风险。针对该模型有进一步手法干预探索的必要性。

2.2.2 佐剂致炎模型 完全弗氏佐剂(Complete freund's adjuvant, CFA)是一种具有代表性的致炎试剂。局部组织注射CFA可以使其引起明显而持续时间较长的慢性炎症痛[23]。本课题组前期[24]采用了CFA在大鼠腰段注射的方法来建立慢性炎性痛模型。CFA注射造模后，患侧的后足PWT和PWL在造模后第1天就表现出差异，第3天、第7天、第10天有显著的降低，有统计学意义(P<0.01)。注射部位的肌肉在光镜下显示组织间质小血管壁增厚，周围伴有炎性细胞浸润，肌细胞破裂等现象。造模后，局部肌肉的SP含量较生理盐水注射对照组明显升高，有统计学意义(P<0.01)。提示在CFA注射后局部炎症介质水平升高。模拟推拿手法干预后，大鼠在Catwalk步态分析参数中的最大接触面积、足印宽度、足印长度等指标均开始出现上升的趋势。说明手法对大鼠产生镇痛效应的同时也会对运动功能呈现良好的结局。

3 LBP模型建立的主要因素

3.1 动物模型的客观性与可重复性

动物实验较临床试验的优点在于动物的个体差异不明显，组间差异较小。因此利于开展实验的动物模型也应该具有易重复、标准化的特征。本文叙述的CCD、SNL模型均是不同程度损伤或卡压外周神经而形成的神经病理痛模型，而ELFS模型和佐剂致炎性痛模型更偏向于一种慢性炎性痛模型。CCD模型是卡压背根神经节形成的模型，背根神经节是各椎间孔内侧面附近脊髓背根的膨胀结节。SNL模型是结扎脊神经形成的模型，脊神经是混合神经，包含躯体运动和躯体感觉。两者和脊柱手法临床均密切相关。这两者模型相比，CCD模型造模需要影像学检测作为辅助确定是否将钢棒插入椎间孔中，而SNI模型制备更加简单且客观。ELFS模型手术过程比较耗时，定制耗材较昂贵，但是根据既往脊柱刚度和PBA测量得知，该模型的稳定性较好。佐剂注射模型经济方便、耗时短、造模简单。注射CFA所制作的大鼠腰痛模型也可用于中医手法进行脊柱病相关的基础研究。

3.2 动物模型与临床症状的贴切程度

上述模型不论是坐骨神经上还是脊柱上成模均能诱发实验动物的痛觉过敏。除了坐骨神经的直接性压迫或创伤损伤造成的疼痛，临床中也可多见由于腰椎间盘突出症引起的下肢放射性疼痛等症状。CCD模型是外部物质(L型钢棒)侵犯DRG造成动物的下肢疼痛，这与临床中椎间盘突出卡压神经根造成的病理性疼痛有相似之处，因此该模型能较好模拟神经病理痛。美中不足的就是插入椎间孔的钢棒会随着动物的运动产生轻微移动，若实验周期较长则易发生脱落。因此改良不易脱落的L形钢棒值得我们进一步探索。根据中医理论，“骨错缝，筋出槽”是脊柱病发病的重要机制之一，脊柱关节紊乱通常是一种动态的生物力学损伤或一种关节内的变化，这种动态的关节内的变化常会导致脊椎关节的失稳及损伤[25]。人体脊柱是在动态与静态交互状态下来体现运动力学的特征，并维持脊柱正常活动的生理机能。有研究采用运动装置测量椎间关节后发现，节段失稳的椎间关节总的屈伸运动通常很小，矢状旋转、轴向移位和剪切移位也明显减少[26]。ELFS模型大鼠在造模后的2～12周后可以发现脊柱刚度较对照组出现了不同程度的增强、椎体后缘所成的锐角(Posterior body angle, PBA)出现了大幅减少，提示关节活动度下降。这也说明该模型能较好反映临床中下腰痛患者脊柱长期慢性损伤后的临床变化[27]。

CFA等佐剂注射可以引起局部形成炎性微环境。炎性微环境可通过改变疼痛相关离子通道、痛觉突触传递效能等导致疼痛传递通路结构变化，诱发慢性疼痛。外周伤害性感受器接受炎性因子刺激而产生神经冲动，经背根神经节整合后反馈至大脑皮层产生疼痛。因此，该神经传导途径提示推拿手法可通过炎性因子的减少、抗炎因子的增多来减少神经冲动传导、降低中枢兴奋性等途径而起到镇痛作用。

3.3 不同动物模型的手法干预时间及部位选择

临床上，医生会根据患者的耐受程度、发病的轻重缓急症状等主观或客观因素给予不同的治法治则以及不同轻重的手法，以达到最好的治疗效果。患者出现红肿热痛等急性反应时，应慎用手法治疗。而在疾病向慢性疼痛中转归后，配合手法镇痛，促进局部瘀血消散、吸收，以提升治疗获益率。

CCD和SNL模型在术后立即可呈现疼痛表现，并且神经病理痛模型并无剧烈的炎症反应，可以立即予以手法介入。ELFS作为一种在无菌条件下通过外部植入金属固件对大鼠的脊柱进行外固定的造模装置，在造模后的1周内，肉眼可明显观察到大鼠的背部由于疼痛而具有不同程度的挛缩、隆起。由于手术时需要将背部皮肤切开，因此局部有水肿及炎性物质渗出。如果此时在对动物进行治疗时，大鼠会由于急性期的疼痛而出现抗拒、躯体扭动摆脱等不配合状况。局部肿胀现象直到第7～10天逐渐消退，因此本研究对造模组大鼠的手法介入选择在造模2周结束后进行。

不同模型操作部位选择也相对有差异。造模部位在腰部，以上模型手法选择既可以选择下肢部相关穴位，例如承扶穴、承山穴、委中穴，以期与“腰背委中求”的治疗原则相对应；也可以在局部进行治疗，例如华佗夹脊、肾俞穴等，同样符合中医“阿是穴”的治疗原则。

3.4 疼痛的中医理论与模型关联性

依据中医理论，疼痛发生主要分为“不荣则痛”“不通则痛”。“不荣”在此处多指气血不足，而“不通”意为气血不通，前者为虚证，后者为实证。中医对于疼痛的治疗积累了丰富的临床经验，其中手法针对“不荣”“不通”而引起的疼痛进行治疗已具有悠久历史。《素问·血气形志篇》曰：“形数惊恐，经络不通，病生于不仁，治之以按摩醪药。”指出素体虚弱而情志受影响，经络因气机紊乱而不通，造成肢体麻木不仁之症状，宜用推拿和药酒作为主要治疗手段。如类似“不荣”的情况，宜选用轻柔的手法用补法的原则进行治疗，则达“按之则热气至，热气至则痛止矣”之效。当神经损伤时，从伤害性感受器末端释放出的CGRP和SP会导致组织水肿并促进炎性因子释放，使得伤害性感受器敏化，产生异位放电。感觉神经受损后，久而久之部分神经元逐渐凋亡，可导致表皮内疼痛感受器分布降低，造成感觉缺失[28]。这也能解释“不荣”而引起的“不仁”现象。

中医认为“骨缝开错”也是导致气滞血瘀证疼痛的发病病因，并且可以通过推拿治疗起到散肿止痛的作用。《医宗金鉴·正骨心法》中提到：“因跌扑闪失，以至骨缝开错，气血郁滞，为肿为痛，宜用按摩法。”这是中医手法在“不通则痛”的具体运用，可适当选用频率较快的手法，以通闭塞而达散结消肿之功。基于以上讨论，适合的动物模型也为进一步探索中医手法治疗“不通”“不荣”的现代依据提供基础。

4 总结

以上4种疼痛模型均有各自的特点，也各有利弊，具体选择何种模型还需取决于研究人员的研究内容。就手法干预脊柱病基础研究而言，通过对模型客观性、科学性、贴合临床症状等基本情况的比较，CCD模型、SNL模型适用于手法干预慢性神经病理性疼痛方面研究，而ELFS模型更适合观察手法干预由于长期软组织及关节劳损引起的下腰痛。佐剂致炎模型可以模拟出临床上脊柱病患者炎性因子上调的病理指标，但是无法涵盖脊柱病慢性形成过程中的生物力学等参数。随着中医药研究的深入，手法在防治脊柱病方面进行了大量的基础和临床研究，取得了一定成果。因此建立以中医理论为指导、符合中医手法病因病机的脊柱病相关模型尤为重要，可为相关中医手法干预手段防治本病提供更可靠的依据。