PNPLA3对肝细胞和肝癌细胞脂质代谢的影响*

宁宝烁 综述，李异玲 审校

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种无过度饮酒史的脂肪性肝病。 是常见的慢性肝病之一[1]，表现为肝细胞的胞质中以脂滴形式存在的甘油三酯累积，肝细胞发生脂肪变性、坏死以及炎性细胞浸润等。突变基因 PNPLA3 I148 M与 NAFLD的发生发展联系密切，且与非酒精性脂肪性肝炎( nonalcoholic steatohepatitis， NASH)、肝纤维化及肝癌的发生密切相关，与酒精性肝硬化及其所致肝癌的临床转归及预后的临床转归相关。可以推测PNPLA3基因在肝脏脂肪代谢中起着重要作用，其表达水平与脂肪代谢密切相关。NAFLD的发病机制复杂，其确切机制尚未完全明了。 多数研究者认为NAFLD发生的关键是能量代谢稳态异常，肝脏甘油三酯合成分解转化异常导致甘油三酯积聚[2，3]。 国外研究显示含patatin样磷脂酶域3(patatin-like phospholipase domain containing 3， PNPLA3)基因多态性与 NAFLD的发生进展有密切联系[4]。2008年Rome等人发现PNPLA3 I148M基因突变与NAFLD有关[5]。PNPLA3称为脂肪营养素(adiponutrin)，属于 patatin样磷脂酶家族，编码一种由481个氨基酸组成的可溶性非分泌性蛋白，在 N端包含有高度保守序列 Gly-X-Ser-X-Gly(具体氨基酸位置为 Gly45-Gly49)[6]。

脂肪组织和肝脏是脂肪代谢的主要部位，人属PNPLA3在肝脏中表达量最高，其次为皮肤和脂肪组织[7，8]。而PNPLA3在小鼠脂肪组织和肾上腺中表达，在小鼠其他组织和器官中基本不表达。 PNPLA3的表达与机体的营养状况紧密相关。 胰岛素和葡萄糖可以刺激脂肪组织中PNPLA3的表达，胰岛素含量正常的糖尿病患者的PNPLA3表达水平平均是正常人的两倍多，如果患者患有高胰岛素血症，而血糖水平正常，这类病人体内的 PNPLA3平均表达量为正常人的5倍左右[9]。 进食情况也可以影响PNPLA3的表达，空腹时表达较低，进食碳水化合物后表达升高。 在动物实验中，禁食19小时后，PNPLA3表达水平显著降低，几乎无法测得。而经过8个小时的恢复进食使其又恢复到初始水平[10]。 食物中不同营养素会影响PNPLA3的表达。 进食大量碳水化合物使小鼠体内 PNPLA3表达水平明显升高[11，12]，进食高蛋白食物也有同样的效应， 然而，高脂饮食并不会导致 PNPLA3高表达[12]。 长期食用高脂饮食可以增加某些脂肪因子的表达[13]，而大量的碳水化合物饮食使肝脏中的 PNPLA3 mRNA水平升高了90倍[14]。 对于人类研究，Liu[15]在2004年第一次研究肥胖患者PNPLA3基因表达的调节。 该研究发现肥胖女性和非肥胖女性之间PNPLA3表达水平无显著差异。 短期或长期的极低卡路里饮食(VLCD)显着降低PNPLA3的表达，并且再次进食导致PNPLA3表达水平恢复正常。

PNPLA3的结构类似于脂肪组织中的非钙离子依赖性磷脂酶 A2( patatin-like phospholipase domain containing2， PNPLA2ATGL)， PNPLA2具有甘油三酯脂肪酶和酰基甘油转酰基酶活性，在脂滴表面催化甘油三酯水解为甘油二酯和游离脂肪酸。PNPLA3的表达对脂肪细胞的分解供能有正向调节作用[15]。

关于 PNPLA3表达调控的机制， Perttilä[16]发现 PNPLA3启动子区存在碳水化合物反应元件( carbohydrate response element， ChRE)，葡萄糖通过该元件结合蛋白( ChRE binding protein， ChREBP)在转录水平调节 PNPLA3的表达;而 SREBP-1(Sterol-regulatory element binding protein 1，SREBP-1)可通过其启动子区的SREs (Sterol-regulatory elements，SREs)激活PNPLA3基因转录。PNPLA3定位在细胞膜与脂滴之间，属四次跨膜蛋白，可能通过内质网转高尔基体转运机制， 从内质网转运到脂滴，也可能在细胞膜和脂滴之间执行不同功能[17]。为了解I148M多态性对PNPLA3酶活性影响的机制，He[18]进行了体外实验。三维模型显示，氨基酸的变化没有导致酶活性和酶活性中心变化。 而是由于酶分子中蛋氨酸侧链较长，底物不能与47号位点酶活性中心接触。 这可能是 I148 M多态性使 PNPLA3失活的机制，表明I148M多态性通过使PNPLA3酶失活而引起疾病。

1 PNPLA3与肝细胞脂质代谢的关系

1.1 PNPLA3与人类肝细胞脂质代谢关系 2008年，通过检测“达拉斯心脏研究”( Dallas Heart Study， DHS)中9229个来自北美不同种族个体非同义单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism， SNPs)[5，19]，发现肝脏中甘油三酯含量的升高与 PNPLA3基因紧密相关。 此外，与杂合子相比，纯合子中肝脏甘油三酯含量是杂合子的两倍。在这项研究之后，多项研究[20，21]证实人PNPLA3 I148M基因突变与肝脏甘油三酯含量增加密切相关。

脂肪在肝脏中的积累可能是富含甘油三酯的脂蛋白从肝脏释放入血的过程受到干扰。研究结果表示，在欧亚混血儿人群中，PNPLA3基因突变与apoB载脂蛋白分数密切相关。每个PNPLA3等位基因突变可使apoB载脂蛋白分数下降3%，而在群体中，载脂蛋白分数变异应该小于1%。因此认为PNPLA3可能通过参与餐后肝脏脂蛋白合成过程而参与apoB载脂蛋白的代谢[22-26]。除了apoB载脂蛋白，也有文献表示PNPLA3突变可通过抑制微粒体的转运蛋白而影响肝脏的脂肪含量[5]。

PNPLA3参与脂肪合成并且其突变体能使脂肪合成能力提高[27]。调查发现，在11000例欧裔美国人中，PNPLA3突变之后，人体内会发生胆固醇积聚现象，这一关系也在芬兰人群体中出现。PNPLA3I148M多态性可降低总胆固醇和低密度脂蛋白(LDL)，表明它可能在脂蛋白代谢中发挥作用[28]。这些研究基于来自不同地区和种族的人，可能表明PNPLA3多态性与不同地区和种族人群的肝脏脂肪含量有关。这种差异也可能是不同地区和种族肝脏脂肪含量不同的原因之一。进食导致PNPLA3表达上调，表明PNPLA3参与脂肪合成[7，29-31]。一项针对西班牙儿童和青少年的研究[32]发现摄入高碳水化合物膳食会显著增加纯合子儿童的肝脏脂肪含量[33]。其他研究显示，PNPLA3 I148M多态性对肝脏脂肪含量的影响存在性别差异。男性和女性的雌激素水平不同，而雌激素是参与脂质代谢的重要激素之一。 性别差异可能源于激素水平的差异，也可能源于基因差异，还有可能是由于二者共同作用，具体机制则需要大样本人群研究。可以肯定的是，PNPLA3 rs738409基因多态性与NAFLD密切相关，但在NAFLD患者中，PNPLA3的表达与基因型无关[34]。

1.2 PNPLA3与动物肝细胞脂质代谢关系 人类 PNPLA3基因与鼠类 PNPLA3基因仅具有68%的相似性，为了较好地模拟人体内的环境， Eriks Smagris[22]构建了一个更好地反映人体生理状态的动物模型，他们将蛋氨酸( M)替换了小鼠 PNPLA3基因第148位的异亮氨酸( I)。 结果发现，进行常规饮食，含有 PNPLA3 I148 M基因的小鼠肝脏中甘油三酯含量与野生型小鼠并无显著差异。高糖饮食4周后，含有PNPLA3 I148M突变基因的小鼠肝脏中的甘油三酯含量显著高于野生型小鼠。 而且杂合子小鼠肝脏甘油三酯含量介于两种纯合子小鼠之间，但两种饮食在血脂水平未见明显差异。 这一结果显示， PNPLA3并不是小鼠肝脏主要的甘油三酯水解酶，小鼠体内甘油三酯的含量升高是由于产生 PNPLA3-I148 M突变蛋白， 而不是因为野生型酶失活。这表明PNPLA3I148M与NAFLD的相关性来自于获得的新功能，而不仅仅是简单的功能丧失。此外，该研究还提示饮食因素在PNPLA3 I148M突变基因诱导肝脏甘油三酯含量增加过程中的重要性。

Li JZ,et al[23]发现过表达PNPLA3 I148突变基因的小鼠中，甘油三酯和胆固醇水平明显高于野生型小鼠，也验证了 PNPLA3与甘油三酯含量升高有密切联系。 PNPLA3 I148M突变后在增加甘油三酯合成的同时降低了甘油三酯中不饱和脂肪酸的比例[23]。 国内有研究发现，感染含 PNPLA3基因腺病毒的小鼠肝脏细胞能有效表达 PNPLA3基因，小鼠 PNPLA3基因明显增加了胞内甘油三酯含量，但对胞内胆固醇含量没有影响。PNPLA3基因在小鼠肝脏中的过度表达增加了VLDL中的甘油三酯含量以及血清甘油三酯水平，并且促进肝脏分泌VLDL。但不影响肝脏以及血清中的胆固醇和游离脂肪酸等指标。而小鼠 PNPLA3基因的瞬时敲低不影响血清和肝脏中的甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸等生理指标[24]。Naokikumashiro et al[25]等人用SAO (specific antisense oligonucleotides)作用于高脂饮食的大鼠来降低 PNPLA3的表达，结果发现降低表达可以减轻肝脏脂肪变性，因此推测 PNPLA3脂肪合成活性可能占其主导地位。而PNPLA3在体外具有甘油三酯水解酶的作用，但其在进食碳水化合物时表达量增加。在293 A细胞中过表达小鼠 PNPLA2基因导致胞内甘油三酯水平降低，而过表达小鼠 PNPLA3基因，胞内甘油三酯水平具有增加的趋势[29]。PNPLA3的表达形式与瘦素的表达形式十分相似，提示它们可能具有相似的调节机制。瘦素缺乏引起的肥胖小鼠脂肪组织中PNPLA3 mRNA的水平降低约2倍。Western检测表明，大多数PNPLA3分布在细胞膜上，但分布在细胞质中的PNPLA3具有更强的甘油三酯分解能力[30]。这可能是由于与底物的微弱相互作用或翻译后的修饰调节不同。在酰基转移方面，将 PNPLA3与 C14标记的甘油一酯共同孵育，合成含有 C14标记的甘油二酯和甘油三酯，提示 PNPLA3参与了甘油三酯的合成过程。此外，除了正常动物的肝细胞，研究发现， PNPLA3 I148M影响大鼠肝癌细胞 McA-RH7777中 VLDL的分泌，这可能是由于甘油三酯动员能力的降低[35-42]。与敲除基因小鼠相比，过表达人PNPLA3 I148M突变基因的小鼠肝脏中，甘油三酯水平升高并且脂肪酸合成能力增强[43，44]。 脂肪变性模型靠正常或蔗糖饮食建立，而不是靠高脂饮食，这表明突变的 PNPLA3对脂肪酸从头合成起作用， 而不是对重新吸收的未酯化脂肪酸起作用[45]。

综上所述，结合前述观点，PNPLA3 I148M突变导致肝脏甘油三酯含量增加的机制可能包括以下几个方面：1，人体内肝脏脂肪含量与 VLDL和 apoB100的分泌呈正相关[36]， 人肝脏脂肪含量相同时， I148 M等位基因携带者的 VLDL分泌速度较慢。且过表达I148M突变蛋白的McA-RH7777细胞表现出细胞内甘油三酯含量升高且apoB分泌较慢，而apoBmRNA的合成及稳定性无明显差异。这提示我们PNPLA3 I148M变异能通过影响含apoB脂蛋白的分泌及VLDL的酯化促进肝内甘油三酯含量的增加；2，PNPLA3 I148M通过抑制甘油三酯水解酶的活性促进肝脏甘油三酯积聚。进一步的研究发现，通过与甘油三酯水解酶竞争结合 CGI-58， PNPLA3 I148 M能降低甘油三酯水解酶活性，进而导致肝脏脂肪的聚集；3，PNPLA3 I148M通过增强溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的作用，促进肝脏甘油三酯的合成；4，将PNPLA3I148M基因敲入小鼠肝脏中，肝脏中脂滴含量增加，且脂滴大小显著增大。他们猜测脂滴表面失活的蛋白可能通过限制脂滴通路阻止甘油三酯的水解，造成肝脏TG的积累。PNPLA3的特定功能可能因不同的靶器官而异，并且仍然存在争议。它在肝脏中的主要作用体现在甘油三酯水解过程还是合成过程尚无定论。

2 PNPLA3与肝癌细胞脂质代谢的研究进展

在人肝癌细胞系中，SREBP-1c可使PNPLA3表达[39]。在Huh-7细胞实验中，Huh-7细胞过表达野生型PNPLA3基因，未发现细胞内甘油三酯含量的变化。而过表达 PNPLA3 I148 M引起细胞内甘油三酯含量升高。研究在体外环境中，PNPLA3及I148M变体改变人类肝脏细胞中脂质成分及其合成物成分的机制。他们在Huh-7肝癌细胞系中过表达野生型和突变型PNPLA3，其不表达内源性PNPLA3。 在含有13 C甘油标记的甘油三酯条件下培养细胞，并用17 D标记的油酸进行合成分解实验。通过质谱仪测量细胞中的甘油三酯，甘油二酯和磷脂。 在存在或缺乏脂肪酸的情况下经过比较他们的亚细胞定位而得到进一步关于野生型和突变型之间功能性差异的证据。 实验发现，PNPLA3 I148M的表达在没有改变甘油三酯合成的情况下导致甘油三酯净积累，但其水解作用延迟； PNPLA3诱导脂肪酸在甘油三酯和膜磷脂之间重新分配； PNPLA3的过表达对肝细胞中PA(磷脂酸)没有任何影响； 野生型PNPLA3 ，而不是PNPLA3 I148M，增强甘油三酯的重塑； PNPLA3 I148M比野生型PNPLA3聚集更多脂滴。

关于大鼠肝癌细胞 McA-RH7777的实验中，通过在 McA-RH7777细胞系中过表达人类野生型和突变型 PNPLA3基因来研究细胞内的脂质含量、 apoB的分泌以及甘油酯类的代谢。 结果发现，与过表达 PNPLA3野生型的 McA-RH7777细胞比较，过表达突变型 PNPLA3的细胞内含有更多的甘油三酯， 并且表现 apoB分泌变少、脂肪酸消耗减少，表明过表达突变型 PNPLA3的细胞内，一些与脂质代谢相关功能丧失。 在一项研究一种新型永生人类肝细胞系的脂质代谢特征的实验中[41]， 人们发现在相同浓度的葡萄糖培养条件下，表达野生型 PNPLA3的人类肝细胞 LIV0 APOLY与表达突变型 PNPLA3的 HepG2细胞相比， HepG2细胞含有更多的细胞内甘油三酯。PNPLA3的敲除并不影响在普通培养基中孵育或经高糖油酸处理的HepG2细胞总脂质含量[45]。与研究一致，在体外，PNPLA3的敲除或过表达都没有改变细胞甘油三酯含量[29，46]。这也是可能因为我们的PNPLA3敲除导致PNPLA3蛋白水平仅降低了70%，或许不足以诱导表型的改变。