猫主要器官在猫瘟发病进程中的进行性变化

谢 颖，徐冬怡，胡先丽，王 革，魏学良

(1.西南大学动物科技学院，重庆 北碚 400715；2.重庆市农业学校，重庆 九龙坡 401329)

猫瘟是由猫细小病毒(Feline parvovirus，FPV)引起的一种急性、高度接触性、高度致死性传染病，各种年龄猫均可感染，临床表现以患猫突发高热、呕吐、腹泻、脱水及循环血流中白细胞减少为特点[1]，感染率可达70%，病死率为50%～60%[2]。Harrison T M等[3]的研究表明，自然条件下，猫细小病毒还可感染狐狸、豹、狮子、虎[4]和浣熊等珍惜野生动物，给野生动物保护造成巨大威胁。目前对猫细小病毒病原本身及疾病诊断与治疗的研究较为完善，而缺乏对猫细小病毒感染过程器官动态变化的相应研究。本试验以动物医院搜集的临床猫瘟病猫为病理模型，通过观察猫瘟各时期猫细小病毒对组织脏器的损伤，推断病毒侵染顺序及组织器官受损的顺序，为猫瘟致病机理的研究及其防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病例来源 在重庆各大动物医院选取临床检查猫细小病毒阳性、冠状病毒为阴性的病猫为试验材料，依据其临床症状划分为早期、中期、晚期3组。分组依据见表1。另外选取同窝的60日龄非免疫、猫细小病毒和猫冠状病毒筛查阴性的临床健康幼猫6只，其中3只攻毒制备潜伏期病例，3只作对照。

表1 猫瘟病猫分组依据

1.1.2 主要试剂 猫细小病毒(FPV)抗原检测试剂盒、猫冠状病毒(FCoV)抗原检测试剂盒，均购自韩国安捷公司；透射电镜使用的戊二醛磷酸缓冲液，来自重庆医科大学生命科学研究院电镜实验室；苏木素(苏木色精)、曙红Y(水溶)，均购自成都市科龙化工试剂厂；免疫组化染色使用的枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)、10×PBST缓冲液，均购自上海永叶生物科技有限公司；DAB试剂盒，购自上海信裕生物科技有限公司；猫细小单克隆抗体，购自北京泰德瑞达科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 潜伏期病例的复制 将已确诊为单纯性猫细小病毒感染的病猫安乐死后，取心、肝、脾、肺、肾等，用无菌剪刀剪碎后转入无菌研钵，1∶5加入PBS缓冲液研磨成匀浆，移入无菌离心管差速离心，取上清液并加入青霉素、链霉素，-4 ℃保存，经培养确定无菌后用于潜伏期病例的接种。接种方式为：每只幼猫腹腔注射1 mL，口服0.5 mL。接种后监测幼猫体温、食欲、精神状态等，首次观察到幼猫体温升高时对其进行猫细小病毒的检测。

1.2.2 猫瘟各时期主要器官的病理组织学检查 将潜伏期、早期、中期、晚期共12只病猫安乐死后进行尸体剖检，依次取肠、肝、脾、肾、肺、心、脑，迅速放入10%福尔马林中固定，按照苏木素的使用说明书进行H.E.染色，用Leica TOMY SX-500生物显微镜进行病理组织结构观察并采集图像。

1.2.3 早期病猫主要器官的超微结构检查 将猫瘟早期病猫麻醉后进行活体剖检，无菌条件下取出其心、肝、脾、肺、肾、脑、肠，并在器官离体1 min内从离体器官分离出8块约1 cm3的组织块，迅速投入戊二醛磷酸缓冲液，4 ℃保存并送至重庆医科大学检查。

1.2.4 晚期病猫主要脏器的免疫组织化学法观察 猫瘟晚期病猫主要脏器石蜡切片经脱蜡、抗原热修复、内源性过氧化物酶活性消除、清洗、脱脂、显色、苏木素复染、脱水、封片等过程处理后，进行病理组织结构观察并采集图像。

2 结果

2.1 猫瘟各时期主要器官的病理组织学损伤

2.1.1 潜伏期的病理组织学损伤 肠、脾、肝、肾、心、脑、肺均未见异常。

2.1.2 早期的病理组织学损伤 肠：肠黏膜上皮细胞脱落和小肠绒毛缩短。脾：脾小梁结构变得疏松且有红细胞浸润的现象；脾小结数量增多，生发中心不明显；红髓内出现少量的巨噬细胞。肝：肝组织中发现红细胞淤积、淋巴细胞浸润，小叶间胆管和小叶间静脉扩张，红细胞淤积。肾、心、脑、肺：均未见异常。

2.1.3 中期的病理组织学损伤 肠：肠黏膜出血、坏死、脱落，毛细血管扩张、充血，并伴有炎性细胞浸润(见中插彩版图1A)。脾：被膜增厚，脾小梁排列紊乱；脾小结减少；白髓中出现红细胞浸润(见中插彩版图1C)；动脉管壁增厚，细胞肿胀，管腔狭窄的现象，有大量红细胞浸润。肝：组织中出现红细胞、淋巴细胞浸润；肝小叶的基本结构被破坏，中央静脉内皮细胞出现水肿并发生脱落，肝索与肝血窦排列紊乱，固有结构消失；小叶间胆管和小叶间静脉有红细胞淤积。肾：肾小球毛细血管壁增厚。心：心肌细胞发生肿胀，心肌纤维出现变性、坏死、断裂，部分溶解消失(见中插彩版图1F)；组织间隙中发现淋巴细胞浸润。肺：肺泡壁增厚，肺泡周围毛细血管扩张；肺动脉(见中插彩版图1G)、肺静脉内均有红细胞淤积。脑：静脉内出现红细胞淤积。

2.1.4 晚期的病理组织学损伤 肠：肠黏膜表面出现由纤维蛋白和中性粒细胞等构成的炎性渗出物，黏膜上皮细胞严重坏死、脱落，肠黏膜下层与肌层发生分离(见中插彩版图1B)，固有层出现淋巴细胞浸润，毛细血管扩张充血。脾：组织内出现渗血和淋巴细胞浸润；固有层部分脾小梁变厚，结缔组织增生，部分脾小梁发生变性、断裂；白髓结构消失，中央动脉管壁增厚，管腔变小甚至闭锁；红髓中有大量的巨噬细胞浸润(见中插彩版图1D)。肝：肝小叶的基本结构被破坏，中央静脉内皮细胞出现水肿、脱落，肝索与肝血窦排列紊乱；小叶间胆管和小叶间静脉出现红细胞淤积(见中插彩版图1E)。肾：肾小管上皮细胞肿胀，肾小管管壁变厚，管腔狭窄。心：心肌结构紊乱，心肌纤维间隙变宽，出现断裂、坏死、变性现象，组织间隙有大量红细胞浸润，毛细血管扩张且有红细胞淤积。肺：肺泡壁增厚，肺泡周围毛细血管扩张；肺动脉、肺静脉内均有红细胞淤积。脑：实质血管扩张充血，红细胞淤积，血管周围间隙增宽且有大量炎性细胞浸润，神经细胞发生核固缩(见中插彩版图1H)。

2.2 猫瘟早期主要器官超微结构的变化 肠：眼观可见肠黏膜表面有少量出血点，肠系膜血管充血。电镜下发现受损白细胞(见图2A)，且可见线粒体水肿和空泡化(见图2B)。脾：脾轻微肿大，边缘钝圆，质地变软。电镜下发现脾窦中出现受损白细胞(见图2C)，线粒体出现水肿与空泡化，线粒体内外膜间的间隙变宽且出现髓样结构(见图2D)。肝：肝脏体积稍微增大，被膜紧张，质地脆软。细胞间隙增大，组织内可见受损白细胞(见图2E)，内质网扩张(见图2F)，线粒体出现髓样结构。脑、肺、心、肾：眼观及电镜下均未见明显病变。

图2 感染早期猫相关组织的超微结构变化(标尺=1 μm)

2.3 猫瘟晚期病猫主要器官的免疫组织化学观察 肠：视野下未见阳性细胞(见中插彩版图3A)。脾：强阳性(见中插彩版图3B)；阳性细胞呈片状大量出现，广泛分布于整个脾脏。肝：阳性(见中插彩版图3C)；肝小叶中可见阳性的枯否细胞。肾：弱阳性(见中插彩版图3D)；肾小管间隙中有极少量细胞呈阳性，肾小球和肾小管未见阳性细胞。心：阴性(见中插彩版图3E)；心肌结构正常，未见阳性细胞。肺：弱阳性(见中插彩版图3F)；支气管腔上皮、细支气管上皮、肺泡隔中部分细胞呈阳性。脑：弱阳性(见中插彩版图3G)；部分神经元和神经胶质细胞呈阳性。

3 讨论

3.1 猫瘟各时期主要器官的病理组织学损伤

3.1.1 潜伏期 潜伏期未见明显变化，推测可能是猫细小病毒正处于增殖阶段，未来得及对机体组织器官造成损害，以致未观察到明显病变。

3.1.2 早期 病理组织学结果显示，肠道、脾脏在早期损伤较为严重，肝脏病变轻微，其他器官未见明显病变，说明这一时期猫细小病毒主要侵袭肠道和脾脏，然后再进一步地侵袭机体其他器官。早期病猫的机体正处于积极的免疫应答阶段，此阶段会产生白细胞和免疫球蛋白等物质抵御猫细小病毒的侵袭。

3.1.3 中期 病理组织学结果显示，猫瘟中期病猫的主要组织和器官已广泛受到侵害并发生病变，在这个时期由于机体免疫系统受到了破坏，猫细小病毒得以继续对机体其他主要器官进一步侵袭。但是中期病猫的脑、心、肺的眼观病理变化并不明显，故可推测猫瘟中期细小病毒首先侵害脾、肝，后侵袭肾、心、肺、脑。

3.1.4 晚期 病理组织学观察结果与邢建民[7]的观察结果相似，这一时期机体各个内脏器官均有明显的病理变化，这些进一步反映了猫细小病毒的泛嗜性和猫细小病毒对机体各主要器官的进一步破坏。晚期猫瘟病猫机体出现多器官、多系统的病变及衰竭而使得该病的治疗难度更大，治愈率更低。从肠道上出现的不可逆的损伤来看，晚期病猫的治疗价值并不高。

3.2 猫瘟早期猫细小病毒对脏器及组织的损伤 电镜观察发现，猫细小病毒对器官及组织的损伤多表现在线粒体的结构损伤上，受损细胞线粒体多出现肿胀、空泡化、髓样结构等变化。线粒体是细胞内重要的半自主细胞器，参与细胞氧化供能及细胞凋亡的调控过程。在细胞受到损伤时，线粒体首先受到影响而改变正常结构，而线粒体的损伤造成细胞内ATP合成障碍及氧化磷酸化失调等变化，这些变化又能进一步造成细胞及线粒体的损伤从而加速细胞凋亡过程。

猫细小病毒在早期即侵害脾脏。脾脏是机体最大的免疫器官，在机体的免疫保护、免疫稳定和免疫监视中起重要作用。推测猫细小病毒选择将脾脏作为早期的侵害对象，可削弱机体免疫保护能力，为进一步增殖准备。

早期感染时还发现猫细小病毒已侵害肝脏，造成肝脏内白细胞受损，内质网扩张及线粒体髓样结构的出现，肝脏是机体重要的解毒器官，但猫细小病毒选择在早期侵害肝脏的具体原因还需进一步研究。

3.3 猫瘟晚期病猫主要脏器的免疫组织化学研究 本试验通过对猫瘟病猫的主要器官进行免疫组化染色从而确认猫细小病毒抗原在组织中的分布情况。从染色的结果可以看出，猫细小病毒抗原在晚期猫瘟病猫的主要器官中的分布存在差异性。脾脏为强阳性表明该器官中病毒分布最广，病毒含量最高，这一结果再次验证了猫细小病毒主要侵害快速分化或快速分裂组织的特性。肝脏为阳性，与病理组织学观察的肝脏的严重病变一致。肾脏为弱阳性，这与病猫可以通过尿液排毒的现象相符。肺为弱阳性，表明猫细小病毒对肺脏侵害程度较小。脑为弱阳性，与晚期病猫并未出现神经症状相符。心为阴性[8]，提示心脏并非猫细小病毒的主要侵害的器官，这与临床上很少见猫瘟病猫发生心衰等心脏问题的现象一致。晚期肠道出现阴性反应与H.E.染色中观察到的肠道组织的严重病变不符，推测可能存在假阴性，假阴性可由组织内待测抗原的分解破坏、抗原含量过低、醛类固定剂对抗原的遮盖、抗体质量不佳或稀释不当、技术操作失误等导致，这种推测有待进一步的试验进行验证。

4 结论

猫瘟对机体组织器官的损伤是多系统多器官性的，早期猫细小病毒主要损伤肠、脾、肝，其对脾脏的侵袭为后续侵害机体创造条件。猫瘟早期病猫的器官首先在肠、肝、脾出现病变；中期主要是肾、心、肺出现病变；晚期主要是脑出现病变。猫瘟晚期病猫肠道受到不可逆的损伤提示晚期的治疗意义不大。