猪流行性腹泻病毒抗原免疫层析检测方法的建立与临床应用

张艳萍 , 王会勤 , 马 鹏 , 刘芮祎，贺南航

(广东爱苏生物科技有限公司，广东 广州 510320)

自2010年以来，由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻在我国多省份广泛流行，且反复暴发，给养猪业造成了巨大经济损失。引起猪病毒性腹泻的病原主要包括猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒A(PRoVA)，3种病毒所引起的腹泻症状相似，易造成漏诊和误诊[1]，因此建立PEDV病原快速检测方法意义重大。

目前，猪流行性腹泻病毒常用的检测方法包括PCR、ELISA、病毒分离、血清学试验等[2]。检测样本一般为腹泻猪的粪便或呕吐物，病死猪的小肠内容物等。PCR、ELISA 方法需要专业仪器，较适合实验室诊断，不便于猪场现场检测。胶体金免疫层析方法(Gold immunochromatographyassy，GICA)是20世纪90年代发展起来的一种新型体外诊断技术，运用肉眼可见的标记物(胶体金或染色乳胶)而得到直观的实验现象(显色)，使得这种分析技术具备操作快速简便、无需仪器、结果准确、灵敏，可常温下运输保存等优点，已广泛应用于生物医学等各个领域。

本试验采用本公司在人类疾病体外检测领域业已成熟的胶体金免疫层析技术，建立猪流行性腹泻病毒检测方法，将胶体金免疫层析检测方法与猪场病原现场检测技术结合，实现基层兽医随时进行活体猪只体检和诊断的目标，实时监控猪场疫病疫情，及时指导养殖生产。

1 材料与方法

1.1 材料 抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体(mAb)PEDV-B1、PEDV-B2、羊抗鼠IgG多抗，均购自长沙优异特生物科技有限公司；猪流行性腹泻病毒RT-PCR试剂盒，购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。猪流行性腹泻病毒疫苗，购自福州大北农生物技术有限公司，批号为2018006。猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性病料，均由中山大学生命科学院郭春和博士实验室提供，现场检测。

二水合柠檬酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和碳酸钾，均为广州化学试剂有限公司产品。氯金酸、BSA、蔗糖，均购自Sigma公司。铝箔袋、塑料卡、吸水纸、PVC 底板，均为上海捷宁生物科技有限公司产品；聚酯膜、玻璃纤维素膜，均为上海金标公司产品；硝酸纤维素膜，上海杰一生物技术有限公司产品。

1.2 仪器设备 三维平面点膜喷金仪HM3030、CM4000 型切条机，上海金标生物科技有限公司；高速冷冻离心机H-2100R，长沙湘仪离心机仪器有限公司；紫外连续扫描分光光度计，Thermo公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；C1000 Touch PCR仪,Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 胶体金溶液的制备 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，根据胶体金制备原理[3]，通过在制备过程中改变添加柠檬酸三钠的量来改变胶体金颗粒粒径的大小。在圆底烧瓶中加入500 mL超纯水加热至煮沸，加入10 mL 1%氯金酸溶液，10 min 后加入12 mL 1% 柠檬酸三钠溶液，此时溶液颜色由黑色逐渐变为酒红色。继续煮沸10 min 后停止加热，冷却至室温，4 ℃贮存。紫外分光光度计扫描检测胶体金溶液质量。

1.3.2 抗原最佳标记浓度与最佳包被浓度的确定 取1 mL 胶体金溶液，以4为梯度距离加入4～24 μL浓度为0.1 mol/L的碳酸钾(K2CO3)溶液调节pH，固定PEDV单抗B1添加量为0.02 mg/mL, 以胶体金与抗体反应10 min最低K2CO3浓度作为最佳标记pH。

用确定的最佳标记pH，将PEDV单抗B1分别按照0.01、0.02 mg/mL和0.04 mg/mL标记。PEDV单抗B2分别按照0.8、1.0 mg/mL和1.2 mg/mL 包被在T 线位置，进行正交试验，检测PEDV阳性样本、弱阳性样本和阴性样本。选择弱阳性样本显色明显且阳性病毒样本与弱阳性病毒样本显色差异最大的组合为最佳条件。在此条件下，羊抗鼠IgG 分别按照0.5、0.8、1.0 mg/mL和1.2 mg/mL包被在C 线位置，检测PEDV阳性样本，选择C线显色强度与T线相当的包被浓度为最佳条件。

1.3.3 PEDV检测卡的制备 将包被有PEDV单抗B2和羊抗鼠IgG 的硝酸纤维素膜、喷有PEDV单抗B1偶联胶体金的聚酯垫、玻璃纤维滤纸与吸水纸组装在PVC底板上，用切条机切成4.0 mm宽的试纸条，装入检测卡壳中，即为最终的检测卡。

1.3.4 检测方法的确定 将PEDV阳性、弱阳性、阴性样本分别取50、80、100 μL和150 μL加到加样孔中，室温反应10、15、20 min和30 min观察结果，确定加样量及反应时间。

1.3.5 结果判定方法的建立 用检测卡检测PEDV样本，检测卡窗口仅在C区出现1条红色反应线，结果为阴性；T区和C区均出现1条红色反应线，结果为阳性；若C区无红色反应线出现，表示结果无效，建议用新检测卡重新进行检测。

1.3.6 检测卡特异性检测 用PEDV检测卡分别检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒，确定本检测卡的特异性。

1.3.7 检测卡灵敏度检测 用500 μL 病毒含量为1.0×105.7TCID50/mL的PEDV 细胞毒倍比稀释来检测制备的检测卡的灵敏度。测定该检测卡能检出的最高稀释倍数对应的病毒含量。

1.3.8 检测卡重复性及加速稳定性检测 用PEDV阳性、阴性样本检测PEDV试纸条的批内及批间稳定性，每份样本重复检测10次，考察其重复性。将检测卡放置于50 ℃温箱中，每周检测1次，考察检测卡的热加速稳定性。

1.3.9 临床样本检测 通过收集在广东、广西等发生腹泻的猪场临床粪便样本，随机选取80份腹泻猪的粪便样本，分别用猪流行性腹泻RT-PCR试剂盒、本文制备的PEDV检测卡检测。

2 结果

2.1 胶体金溶液扫描结果 以双蒸水为对照，用紫外分光光度计在400～700 nm连续扫描，测定吸收曲线和吸收峰(见表1)。结果为λmax=531 nm，ODmax=0.168 0。所制备的胶体金颜色为透明的酒红色，液面无油质类漂浮物，可用于试纸条制备。

表1 胶体金溶液扫描结果(峰值附近部分)

2.2 抗原最佳标记浓度与最佳包被浓度 胶体金中加入16 μL 0.1 mol/L K2CO3溶液调节pH时，标记抗原没有死金或变紫现象，调节后的胶体金溶液的pH在8.0 左右。通过正式试验，确定PEDV单抗B1按0.02 mg/mL 标记，T线PEDV单抗B2按照1.0 mg/mL包被、C线羊抗鼠IgG 按照0.5 mg/mL包被为最佳条件组合。

2.3 检测卡的制备与组装 该检测卡由采集部件与检测部件2个部分组合而成。为一种具有特殊结构与材质的开孔型桨形采集器，具备较强的亲水性能与快速传输液态样本的能力。本品采集活体待检猪粪便样本后，在洗脱液的配合下，粪便样本中体积较大物质被阻止在采集器表面或脱落至展开剂中，体积较小物质(如水、无机盐、病毒、细菌、蛋白类等)则可顺利通过采集器，传输至检测部件。检测部件即组装好的试纸条部分、上盖和底盖(如图1)，最后通过焊接机将4个部分压紧即可。

图1 PEDV检测卡组成

2.4 样品检测方法的确定 通过对比不同加样量和反应时间对检测结果的判定影响，最终确定将样本80～100 μL加到加样孔中，室温反应15 min，为样本的检测条件。

2.5 结果判定方法的建立 用检测卡检测PEDV阴性样本，检测卡窗口仅在C区出现1条红色反应线，结果为阴性。检测PEDV阳性样本和弱阳性样本，T区和C区均出现1条红色反应线，结果为阳性，T线显色无论深浅均代表样本中含有PEDV，提示猪流行性腹泻的发生。若C区未出现红色反应线，无论T区是否出现反应线，该检测卡结果均为无效，应更换检测卡重新测试。

2.6 检测卡的特异性 用PEDV检测卡分别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。除了检测自身PEDV为阳性以外，其他结果均为阴性，说明PEDV检测卡与以上几种常见病毒均无交叉反应，特异性好。

2.7 灵敏度检测 用1头份/mL PEDV 疫苗(该批次的疫苗生产检验报告显示PEDV实际病毒含量检测结果为1.0×105.7TCID50/头份)进行灵敏度检测，用0.2 mol/L的PB缓冲液倍比稀释，确定检测卡的灵敏度。结果最低能检测到稀释104倍的病毒液，约100 TCID50的病毒量，如图2所示。

图2 PEDV检测卡灵敏度检测结果

2.8 检测卡重复性结果及加速稳定性检测 从同批次试纸条中随机抽取10根进行重复试验，检验结果完全一致，符合率为100%。批内和批间检测重复性好(见图3)。

图3 批内及批间重复性检测结果

将检测卡放置于50 ℃温箱中，每周与常温条件下存放的检测卡对比检测，结果检测卡在50 ℃下保存10周其检测结果无明显差异，可依此确定检测卡室温保质期最少为12个月。

2.9 临床样本检测 用PCR试剂盒和胶体金检测卡分别对来自广东、广西的80份腹泻猪粪便样本进行检测。胶体金快速检测卡检测只需用样本采集部件直接刮取粪便，然后插入1.0 mL的PB缓冲液中，等待15 min即可进行结果观测；PCR检测方法按照相应试剂盒说明书进行操作。2种方法检测结果见表2。

表2 PEDV病原PCR检测与本文胶体金检测卡检测结果统计

以PCR检测结果为标准，检测卡的灵敏度为94.7%(36/38)，特异性为100%，Kappa值为0.949 7。结果表明，PEDV胶体金免疫层析检测卡与PCR检测具有很好的一致性，说明PEDV检测卡用于兽医现场筛查和确诊病情具有很强的指导意义。

3 讨论

PEDV抗原粪便免疫层析检测卡将胶体金标记技术、免疫层析技术和样本采集新技术结合起来，发展为一项新型体外诊断技术。该技术操作简便，集临床猪粪便样本的采集和检测于一体，无需另行处理样本,如样本洗脱、离心等，结果准确，可广泛应用于动物养殖生产。目前PEDV病原学检测方法主要是聚合酶链式反应(PCR)检测，灵敏度高，但检测结果相对于发病时间具有明显滞后性，不利于养殖生产一线早期检测该病，一旦发现问题立即进行紧急免疫和隔离防护的控制处理方针。所以，胶体金免疫层析快速检测产品能很好的解决这一问题。目前，建立能同时检测猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和轮状病毒等常见腹泻病毒的快速检测卡对于基层兽医快速鉴别诊断几种病毒性腹泻病毒意义重大，这将是今后值得进一步研究的课题。灵敏度是衡量试纸条性能好坏的重要指标，本试验通过优化胶体金标记反应条件、金标稀释液、样品稀释液和样品垫的制备条件，最低能够检测到100 TCID50左右的病毒量，并且可以检测到临床样本中的野毒。

通过临床样本检测试验证实:本文所建立的猪流行性腹泻病毒胶体金免疫层析法检测卡具有良好的灵敏度和特异性，与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒等症状相似的疾病无交叉反应；检测卡与PCR检测方法对比，结果一致性高达94.97%。同时试剂盒在常温下至少可保存1年，对同一样品的重复试验结果一致，说明其具有较好的稳定性。猪流行性腹泻病毒胶体金免疫层析检测卡使用方便、成本低，可用于猪场发生病毒性腹泻疾病的快速检测，适合基层兽医站和养殖企业使用。