基于宏基因组学研究分析黑叶猴肠道微生物的多样性

段春慧，王兴金，李婉萍，李 超，蒋丽霞，李毅峰，余建国

(1.广州动物园，广东 广州 510070；2.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193；3.梧州市园林动植物研究所 梧州市黑叶猴保护研究中心，广西 梧州 543000)

哺乳动物的消化系统中含有一个复杂的微生物群落，它们是宿主消化系统不可或缺的一部分[1-2]。近年来，高通量测序技术的应用和发展，进一步揭示了肠道微生物群在动物健康和代谢中发挥的日益重要的作用[1,3-4]。因此，了解特定动物类群中肠道微生物的组成结构，对研究动物肠道微生物与宿主本身的协同进化具有重要意义[5]。

灵长类动物已经进化了数百万年，适应了各种各样的栖息地和饮食[6]。黑叶猴(Trachypithecusfrancoisi)是世界上珍贵稀有灵长类动物之一，属于我国一级重点保护野生动物，主要分布于中国的广西、贵州及重庆[7]，栖息于热带雨林、季雨林、亚热带常绿阔叶林及石山灌丛等地[7]。人工饲养条件下的黑叶猴可能受到气候、饲养环境、食物结构等的影响，其肠道菌群也随之发生改变。

宏基因组学作为新兴的分子生物学技术被广泛用于开展微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性以及其相互关系等相关研究[8]，可以更准确地反映出微生物生存的真实状态。因此，研究非人灵长类如黑叶猴肠道菌群，对理解宿主的食性适应和监测宿主的健康状况有重要意义[1]。

本试验通过对黑叶猴粪便16S rRNA及宏基因组测序分析，初步了解黑叶猴肠道微生物的基本组成及主要微生物的种类，并对不同环境下其肠道微生物的丰度、组成及差异进行比较分析。

1 材料与方法

1.1 材料与来源 黑叶猴粪便：分别采集自展区18、展区19、饲养场和梧州组的黑叶猴的新鲜粪便，于-80 ℃保存后干冰运输，用于粪便微生物多样性分析。采样和分组见表1。

表1 采样和分组情况

1.2 方法

1.2.1 黑叶猴粪便总DNA提取 利用粪便基因组DNA提取试剂盒提取各组黑叶猴粪便样品中微生物基因组DNA。完成基因组DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。最终上机测序及部分数据分析由深圳华大基因股份有限公司完成。

1.2.2 16S rRNA的扩增、测序与分析 取质量合格的基因组DNA样品30 ng进行PCR扩增(16S rRNA的V3～V4区)并进行纯化。检测合格后利用HiSeq平台进行测序，测序结果与16S rRNA细菌和古菌核糖体数据库(silva119)比对进行注释，继而进行黑叶猴肠道微生物多样性分析，并对4组黑叶猴的菌群变化进行差异分析。

1.2.3 细菌宏基因组的扩增、测序与分析 取质量合格的基因组DNA样品，使用Covaris超声仪将DNA片段化后获得符合长度要求的短DNA片段。构建文库并通过联合探针锚定聚合技术(cPAS)进行测序。从下机原始序列开始对原始序列进行拆分、质量剪切以及去除污染等优化处理并使用优化序列进行拼接组装和基因预测，对得到的基因进行物种和功能上的注释以及分类。

2 结果

2.1 Alpha多样性分析 本试验通过Alpha多样性(Alpha diversity)分析黑叶猴粪便样品中的菌群丰度。基于16S rRNA测序通过Shannon指数进行Alpha多样性分析，发现4个组中的群落多样性(OUT水平)均较整齐(见中插彩版图1 A)。同时结合宏基因组测序通过Shannon指数进一步评估各组样品菌群丰度，结果显示，4个组中Shannon指数在门、科和属水平均无明显差异(见中插彩版图1 B)。因此本试验基于16S rRNA和宏基因组测序结果均表明各组间微生物群落丰度无明显差异。

2.2 黑叶猴肠道菌群物种与功能组成分析 有研究表明，拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)在所有非人灵长类肠道菌群中所占比例较高[1]。本试验中16S rRNA(结果未列出)和宏基因组结果均显示：门水平上，厚壁菌门和拟杆菌门在肠道微生物的组成中属于优势群体，表明黑叶猴肠道菌群组成以及各菌门间的趋势与多数哺乳动物相似[9]。此外，在展区18和展区19这2组中Spirochaetes(螺旋体门)的占比也(类似16S rRNA结果)略高于另外两组；Proteobacteria(变形菌门)在饲养场组的相对丰度高于梧州组、展区18和展区19三组(见中插彩版图2 A)。

为进一步探究不同饲养环境下黑叶猴肠道微生物多样性，我们利用群落柱形图分析不同样本基于属水平的优势物种及相对丰度。从结果分析来看，在4个组中除去未被注释到的微生物(Unclassfied)，其中梭菌属(Clostridium)、普 雷 沃 氏 菌 属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)、另枝菌属(Alistipes)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、密螺旋体属(Treponema)、颤杆菌属(Oscillibacter)属于4个组中的优势菌群(见中插彩版图2 B)。而丰度略有不同的菌群如梭菌属(Clostridium)在梧州组的相对丰度要高于其他三组；普雷沃氏菌属(Prevotella)和拟杆菌属(Bacteroides)在梧州组的相对丰度要低于其他三组；瘤胃球菌属(Ruminococcus)在饲养场的相对丰度要高于其他三组。

此外，根据微生物种水平群落组成分析发现，在4个组中除去未被注释到的微生物(Unclassfied)，其中Alistipes_sp._CAG:435 和Treponema_succinifaciens属于4个组中的优势菌群。Alistipes_sp._CAG:435在饲养场和展区19中的相对丰度低于其他两组；而Treponema_succinifaciens在展区19中的相对丰度高于其他三组(见中插彩版图2 C)，这可能与展区19未进行消毒，环境微生物较为丰富有关。

2.3 Beta多样性分析 采用Beta多样性具体评估微生物群落间的差异。通过PCA分析发现，在OTU水平，除展区18和展区19有一些重叠，其他各组间菌群组成离散情况较明显，存在较大差异(见中插彩版图3 A)。而利用宏基因组测序进行PCA分析发现，在物种水平梧州组和饲养场组群落构成重叠较多，差异较小(见中插彩版图3 D)；而梧州组和展区19的群落构成相比其离散程度大于梧州组与展区18的群落构成(见中插彩版图3 B、3 C)。

2.4 黑叶猴肠道菌群物种与功能差异比较分析 根据16S rRNA测序结果分析,在属水平中进行组间差异显著性检验发现，丰度在Top 15的群落中，有7个存在显著性差异，分别是：Prevotella_9,Treponema_2,unclassified_f_Lachnospiraceae,[Eubacterium]_coprostanoligenes_group,unclassified_k_norank_d_Bacteria,Christensenellaceae_R-7_group,Ruminococcaceae_NK4A214_group(见中插彩版图4 A)。利用宏基因组测序对黑叶猴肠道菌群差异性进行分析。其中环境丰度最低的梧州组和饲养场2组样本中丰度存在显著性差异的属主要为：Thermosinus、Thermophagus等(见中插彩版图4 D)。梧州组和展区18这两组样本存在显著性差异的属主要为：Unclassfied、Tyzzerella、Tannerella等(见中插彩版图4 C)。而梧州组和展区19两组样本存在显著性差异的属主要为：Tyzzerella、Tannerella、Ruminococcus等(见中插彩版图4 B)，这与梧州组和展区18的比较结果较为相似，也间接说明展区18与展区19环境丰度较为相似。

2.5 黑叶猴肠道菌群功能基因分析

2.5.1 差异基因分析 基于宏基因组测序结果，对各组差异基因进行比对分析，并以火山图表现(见中插彩版图5)。梧州组和另外3个组比较，其差异基因均比较多，在4 000个以上，并且差异基因中的大部分基因丰度低于其他组，这可能与其环境丰度较低有关。本试验中环境丰度从高到低依次为：展区19、展区18、饲养场、梧州组，而结果显示某些差异基因的丰度也呈现类似的规律性。

2.5.2 黑叶猴肠道菌群差异基因KEGG功能分析 基于16S rRNA测序结果，分别进行COG和KEGG功能注释，获得OTU在COG、KEGG各功能水平的注释信息及各功能在不同样本中的丰度信息。结果显示，所有样本的COG功能组成较为相似，在不同饲养区域均未发现较大变化(结果未列出)。对KEGG代谢通路Level 1水平丰度统计分析发现Environmental information processing，Genetic information processing和Metabolism这3个通路的基因丰度最高。因此结合宏基因组测序结果对KEGG注释结果进行分析。宏基因组结果表明，4组在Level 1分类中，Metabolism所含的基因数目最多，其中含基因数目较多的Level 2分类有Global and overview maps，Carbohydrate metabolism和Amino acid metabolism。而Environmental Information Processing中仅有3个Level 2分类水平，其中Membrane transport和Signal transduction的数量最多(见中插彩版图6 A)。

结合宏基因组数据将环境丰度相对较低的梧州组与其他三组差异基因利用KEGG数据库比对而得的功能注释进行分析(数据库内无功能注释的不含在内)。梧州组与其他三组比较，在Level 1分类中，Metabolism所含的基因数目均显示最多，其次是Genetic information processing；含基因数目较多的Level 2分类均含有Global and overview maps、Replication and repair和Membrane transport(见中插彩版图6 B、6 C、6 D)。此外梧州组和展区18组的差异基因整体较多；但Level 1分类水平最少的是Organismal system(见中插彩版图6 C)，而在其他2组比较中最少的是Human diseasess(见中插彩版图6 B、6 D)。

3 讨论

肠道微生物与宿主的健康密切相关，而作为和人类亲缘关系最近的灵长类动物，其肠道微生物研究具有重要意义[10]。近年来，随着16S rRNA和宏基因组测序技术的广泛应用，肠道微生物群研究目前已成为现代生物学领域热点[8]。本试验综合16S rRNA 及宏基因组测序分析了不同饲养环境下黑叶猴肠道微生物群落组成及丰度变化，并对其差异基因功能进行了预测。

本试验中黑叶猴肠道菌群中的优势菌群是在纤维物质消化中起主要作用的厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，这与黑叶猴采食树叶等食性相关[1,7]，且与文献报道一致。而基于属水平所鉴定出的优势菌群梭菌属(Clostridium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)等可帮助黑叶猴分解树叶中的纤维素及降解树叶中的结构性碳水化合物，表明肠道菌群在黑叶猴的营养消化吸收方面起到重要作用[11-13]。

有研究表明，圈养和野生大熊猫群落微生物存在一定差异，这与其栖息环境、食物资源、活动节律等的影响密切相关[14]。本试验综合差异基因比较结果发现，梧州组与另外三组比较，其差异基因均较多，且差异基因中的大部分基因丰度均低于其他组。推测与本试验中环境丰度从高到低依次为：展区19、展区18、饲养场、梧州组。基于物种与功能差异比较分析发现，梧州组与展区19以及梧州组与展区18的比较结果较为相似，这也间接说明展区18与展区19环境丰度较为相似，也可能与展区19 的环境是在展区18的基础上进行改变有关(在展区18中增加垫料且不进行常规消毒成为展区19)。而综合环境丰度与PCA比较分析发现，梧州组和另外三组肠道菌群相比的离散程度随环境丰度的增加而增加，提示微生物群落构成与饲养环境有关(混凝土地面加上消毒杀灭环境微生物)。

瘤胃球菌属(Ruminococcus)等菌群与动物的食性和代谢存在一定的关系[5]。本试验中瘤胃球菌属(Ruminococcus)在四组黑叶猴肠道中属于优势菌群中的一种，而且在四组中存在一定差异。而肠道菌群差异基因功能分析结果显示，4个组中与代谢相关的基因数目最多，这与灵长类动物适应环境温度、食物种类及其摄取营养有关。也因此说明了动物进化过程中，肠道微生物组成结构与动物食性和生活环境密切相关。

近年来，我国已出现一些有关非人灵长类动物肠道菌群的研究，但总的来说研究现状还相对滞后[1]。本试验通过16S rRNA和宏基因组测序对不同环境下黑叶猴肠道微生物进行了比较分析，发现其肠道菌群与环境丰度存在密切联系，对于了解灵长类动物肠道微生物群的组成及其功能具有重要意义。然而虽然通过宏基因组对功能基因进行了分析比较，但具体的影响机制还不明确，有待进一步研究。