P2X7受体在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义*

吴丹，耿爽，胡轶

（华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院 呼吸与危重症医学科， 湖北 武汉 430014）

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因[1]，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%[2]。随着早期诊断和治疗方式的改进，NSCLC发病率有所下降，但5年生存率仍不尽人意[3]。寻找新的预后标志物，对改善NSCLC 预后尤为重要[4-5]。P2X7 受体是由位于12q24.31 位点的P2X7基因编码的细胞膜外受体蛋白，相对分子质量约为120 kD，属于P2X 受体家族成员，可由细胞外三磷酸腺苷激活[6-7]。P2X7R 与多种肿瘤迁移、侵袭及预后密切相关[8-9]。在胰腺癌中，P2X7R 表达可调节癌细胞存活和迁移，采用P2X7R 变构抑制剂可抑制胰腺癌细胞增殖和迁移[10-11]。然而P2X7R 在NSCLC 中的表达及预后鲜见报道且不完全[12-13]。本研究通过免疫组织化学法检测NSCLC 患者癌组织中 P2X7R 的表达，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年1月—2014年1月在华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院行肺癌切除术的118 例患者组织标本。所有病理标本在纳入研究前经2 位病理医师根据NSCLC 病理分期（TNM 分期第8 版）标准[14]重新确认，共30 例患者接受术前新辅助化学治疗（以下简称化疗）。术后患者均按美国国立综合癌症网络（national comprehensive cancer network, NCCN）指南进行后续化疗，未接受分子靶向治疗。纳入标准：患者均接受NSCLC 切除术；除NSCLC 外，不存在其他部位的恶性肿瘤；有完整的临床病历资料和随访信息；按照NCCN 指南原则进行治疗。本研究通过医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集从患者病历资料中提取临床病理资料，包括患者性别、年龄、吸烟状况、肿瘤大小、组织学类型、淋巴结转移及TNM 分期。

1.2.2 随访总生存时间定义为从术后至随访截止日或患者死亡时间的间隔。无瘤生存时间定义为从术后到首次随访发现复发或随访截止日的间隔。

1.3 免疫组织化学染色

将甲醛固定、石蜡包埋的病理组织切成4μm 厚切片，随后将组织切片脱石蜡并在梯度乙醇中脱水。在pH 6.0 的乙二胺四乙酸缓冲液（武汉博士德生物公司）中煮沸3 min 行抗原修复。用3%过氧化氢（武汉博士德生物公司）淬灭内源性过氧化物酶活性30 min。使用P2X7R 单克隆抗体（英国Abcam 公司）在4℃条件下孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶缀合的二抗（美国Sigma-Aldrich 公司）在37℃条件下孵育2 h，用辣根过氧化物酶和3，3'-二氨基联苯胺色原溶液（武汉博士德生物公司）处理载玻片并用苏木精复染。

1.4 免疫组织化学评分

通过评估染色强度和密度来确定免疫组织化学评分：采用阳性细胞百分比结合染色强度对P2X7R表达水平进行评分。染色强度评分：0 分为阴性；1 分为弱阳性；2 分为中度阳性；3 分为强阳性。P2X7R 阳性细胞的百分比评分：1 分为0%～10%；2 分 为＞10% ～50%；3 分 为＞50% ～80%；4 分为＞80%～100%。将两者得分相乘，计算出总得分，分值从0 ～12 不等。总得分≤3 分为P2X7R 低表达；≥4 分为P2X7R 高表达。其中，P2X7R 低表达组46 例，高表达组72 例。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验，Cox 比例风险模型用于预后分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC 组织中P2X7R 蛋白的表达

NSCLC 组织中P2X7R 蛋白阳性染色主要定位于NSCLC 细胞质和细胞膜上，72 例（61.0%）癌组织中P2X7R 呈高表达；46 例（39.0%）癌组织中P2X7R 呈低表达。见图1。

图1 NSCLC 组织中P2X7R 蛋白的表达（免疫组织化学染色×400）

2.2 不同影响因素下P2X7R 蛋白高表达率比较

不同性别、年龄、肿瘤大小、吸烟状态、组织学类型、术前新辅助化疗及术后化疗患者的P2X7R 蛋白高表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而不同TNM 分期及有无淋巴结转移患者的P2X7R 蛋白高表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3 NSCLC 组织中P2X7R 蛋白表达与预后的关系

Kaplan-Meier 生存分析结果显示，P2X7R 高表达组与低表达组无瘤生存率及总生存率比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=5.687 和14.687，均P=0.000），P2X7R 高表达组均低于P2X7R低表达组。P2X7R 高表达组5年无瘤生存率为18.1%，P2X7R 低表达组5年无瘤生存率为25.1%，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=9.254，P=0.000），P2X7R 高表达组低于P2X7R 低表达组。P2X7R 高表达组5年总生存率为23.3%，P2X7R 低表达组5年总生存率为30.1%，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=13.721，P=0.000），P2X7R 高表达组低于P2X7R 低表达组。见图2。

表1 不同影响因素下P2X7R 蛋白高表达率比较（n =118）

2.4 影响NSCLC 患者无瘤生存率的单因素和多因素分析

单因素Cox 比例风险模型分析显示，P2X7R 表达、TNM 分期及淋巴结转移是影响NSCLC 患者无瘤生存率的危险因素（P＜0.05）。多因素Cox 比例风险模型分析表明，P2X7R 表达及TNM 分期是影响NSCLC 患者无瘤生存率的独立危险因素（P＜0.05）。见表2。

图2 P2X7R 高、低表达组无瘤生存率和总生存率比较

表2 多因素Cox 比例风险模型分析影响患者无瘤生存率的因素参数

2.5 影响NSCLC 患者总生存率的单因素和多因素分析

单因素Cox 比例风险模型分析显示，P2X7R 表达、TNM 分期及淋巴结转移是影响NSCLC 患者总生存率的危险因素（P＜0.05）。多因素Cox 比例风险模型分析表明，P2X7R 表达及TNM 分期是影响NSCLC 患者总生存率的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 多因素Cox 比例风险模型分析影响患者总生存率的因素参数

3 讨论

在我国肺癌发病率和死亡率均居恶性肿瘤的第1 位[15]，相对于西方发达国家，我国NSCLC 病死率更高，且呈逐年上升趋势[16-17]。P2X7R 在人体多种细胞中表达，其中以干细胞、神经胶质细胞及内皮细胞表达最为显著，参与调节炎症、细胞增殖和凋亡、代谢及吞噬[18]。

本研究发现，118 例患者中61.0%的患者P2X7R呈高表达；39.0%患者P2X7R 呈低表达，这与最近报道结果类似[19]。有学者采用免疫组织化学和聚合酶链反应检测94 例结直肠癌中P2X7R 的表达，发现高表达51 例，低表达43 例，结果显示在不同肿瘤组织中P2X7R 存在表达差异[19]。本研究结果发现，NSCLC 组织中的P2X7R 表达水平与TNM 分期和淋巴结转移相关，而与性别、年龄、肿瘤大小、吸烟状态及组织学类型无关。BOLDRINI 等[13]报道，并未发现P2X7R 蛋白表达与临床病理因素有相关性，原因可能与其研究所用的样本量偏少及病理类型的异质性有关。

有研究报道，NSCLC 的TNM 分期和淋巴结转移与患者疾病严重程度和肿瘤细胞侵袭性密切相关[4]。上述结果显示，P2X7R 高表达的NSCLC 患者恶性程度更高。通过Kaplan-Meier 生存分析发现，P2X7R高表达的NSCLC 患者预后劣于P2X7R 低表达患者。Cox 比例风险模型分析提示，P2X7R 表达为影响无瘤生存率和总生存率的独立危险因素。BOLDRINI 等[12]报道，P2X7R mRNA 的表达与NSCLC 预后相关，P2X7R mRNA 高表达的NSCLC 患者预后不良，与本研究结果类似。有文献报道，在结直肠癌患者中P2X7R 高表达为影响结直肠癌术后患者总生存率的独立危险因素[19]。尽管文献报道在乳腺癌和前列腺癌的动物实验中均发现P2X7R 表达增强，但并没有P2X7R 表达与预后关系的报道[20-22]。

P2X7R 高表达导致NSCLC 临床预后不佳的机制尚不清楚。其机制可能为：①在体外培养的前列腺癌细胞系中P2X7R 通过激活三磷酸腺苷参与上皮间质转化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）[20]，而EMT 是NSCLC 发生、发展的关键步骤[21]，P2X7R 可能通过影响EMT 而影响NSCLC 的进展；②P2X7R高表达可诱导癌细胞侵袭和转移，在体外培养的乳腺癌细胞系中，P2X7R 高表达或沉默分别促进或抑制乳腺癌细胞增殖能力[22]；③新血管形成是大多数肿瘤进展和转移的先决条件，在胰腺癌模型中发现P2X7R高表达可促进胰腺癌细胞中新生血管形成[23-24]，其是否通过促进肿瘤血管生成参与肿瘤进展值得进一步研究。

本研究为单中心的回顾性研究，纳入病例数较少，尚需要多中心大样本研究来证实本研究结论；同时P2X7R 影响NSCLC 患者预后的分子机制尚需要进一步研究。

综上所述，本研究发现NSCLC 组织中P2X7R高表达与患者恶性临床病理特征及预后不良相关，P2X7R 高表达是NSCLC 患者预后不良的独立危险因素。