慢性心力衰竭与IL-17A基因rs2275913、rs4711998位点多态性的关系

吴薇，李宁，李克研

（1.锦州医科大学附属第一医院 心内科，辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学基础学院生物化学教研室，辽宁 锦州 121000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure, CHF）是一种复杂的临床综合征，发生心脏结构和功能改变，包括心肌细胞死亡、纤维化和电生理重构[1-2]。免疫激活和炎症参与了疾病的发生和发展，表现为多种炎症因子循环水平升高[3-4]。IL-17 由CD4+T 细胞分泌，通过招募免疫细胞参与炎症反应的放大[5]。基因遗传变异可以改变基因的分子特征，改变某些疾病的风险。编码IL-17A基因位于6 号染色体（6p12）上，相关研究已证实人类一些疾病发病风险与IL-17A基因多态性之间存在相关性，如多发性硬化症、胃癌[6-8]。然而，对于IL-17A基因多态性在CHF 发生、发展中起到的作用研究甚少。本文旨在探讨CHF 发病与IL-17Ars2275913（G-197A）、rs4711998（G-197A） 位点多态性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年2月—2019年3月于锦州医科大学附属第一医院心内科的就诊的CHF 患者131 例作为CHF 组。其中，男性75 例，女性56 例；平均年龄（57±48）岁。纳入标准：①CHF 诊断标准参照Framingham 标准[9]，心功能NYHA 分级Ⅱ～Ⅳ级，超声心动图检测LVEF＜45%；②年龄≥18 岁；③CHF病史≥3个月。排除标准：①4周之内发生过心肌梗死；②急性心力衰竭；③合并严重心脏瓣膜病变；④严重肝、肾功能损害及血液系统疾病；⑤严重贫血、甲状腺功能亢进症；⑥风湿性心脏病；⑦恶性肿瘤；⑧严重的急性感染或代谢紊乱。选取同期本院健康体检者80 例作为对照组，其性别、年龄均与CHF 组相匹配。对照组经体检后排除心血管疾病、严重肝或肾疾病、甲状腺疾病、糖尿病。所有研究对象之间无血缘关系，且参与个体均已签署知情同意书，并获得医院伦理委员会的批准。

1.2 基因型判定

1.2.1 标本采集和基因组DNA 的提取受试者抽取空腹外周静脉血3 ml，将标本置于EDTA 抗凝管中并于-80℃冰箱保存备用。采用全血基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），按照说明书进行操作，DNA 样本提取后置入-20℃冰箱冷冻保存。

1.2.2 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）鉴定PCR 引物序列由北京博迈德生物有限公司合成。IL-17A基因rs2275913 正向引物：5'-GCAGCTCTGCTCAGCTTCTAA-3'（21 bp），反向引物：5'-TTCAGGGGTGACACCATTTT-3'（20 bp）。rs4711998正向引物：5'-TTACACTCCAGCCATTGAG TTG-3'（22 bp），反向引物：5'-TGAAAATGGGGAT AGAGACTGG-3'（22 bp）。目的基因扩增PCR 扩增反应体系为25 ml，其中含有8μl DNA 提取物，正反向引物各1μl，2×Reaction Mix 12.5μl，Golden DNA Polymerase 0.25μl，剩余加入ddH2O。扩增反应条件：94℃预变性5 min，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30 个循环，72℃继续延伸5 min，于4℃保存。用2.5%琼脂糖凝胶和溴化乙锭染色将PCR 产物进行电泳，于紫外线透射仪下观察是否扩增成功。IL-17A基因rs2275913（G-197A）位点应用内切酶EcoNI，并在37℃孵育15 min，rs4711998（G-197A）位点应用内切酶TaqI并在65℃孵育1 h，用3%琼脂糖凝胶将酶切产物进行电泳，在紫外灯照射下观察并记录结果。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件，患者经χ2拟合优度检验是否符合Hardy-Weinberg（哈德温伯格）平衡定律，以P＞0.05 为符合Hardy-Weinberg 平衡，表示研究样本具有群体代表性[10]。基因型和等位基因频率用基因频率计数法比较，用χ2检验两组间基因型和等位基因频率分布。基因型与CHF 的发病因素比值比及95% CI 采用非条件Logistic 回归分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-17A基因rs2275913、rs4711998位点PCR产物及基因型判定

PCR 产物电泳后在紫外灯下观察，可见PCR 产物中分别有155 bp 和359 bp 大小的条带（见图1、2）。产物经内切酶酶切，于3%琼脂糖凝胶电泳，7 号样本分别为155 bp、87 bp 和68 bp，基因型为AG；1 号和2 号样本2 条带，分别为87 bp 和68 bp，基因型为GG；3 号和5 号样本仅有155 bp 条带，基因型为AA（见图3）。5 号样本分别为359 bp、206 bp 和153 bp，基因型为AG；1 号和2 号样本2 条带，分别为206 bp和153 bp，基因型为GG；3 号和4 号样本仅有359 bp条带，基因型为AA（见图4）。

图1 IL-17A 基因rs2275913 PCR 产物

图2 IL-17A 基因rs4711998 PCR 产物

图3 IL-17A 基因rs2275913 PCR 产物酶切分型鉴定

图4 IL-17A 基因rs4711998 PCR 产物酶切分型鉴定

2.2 CHF 组IL-17A 基因rs2275913、rs4711998位点与对照组实际、预期基因频率比较

CHF 组IL-17A基因rs2275913 实际与预期基因频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；对照组实际与预期基因频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明研究样本具有群体代表性。CHF 组IL-17A基因rs4711998 实际与预期基因频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；对照组实际与预期基因频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明研究样本具有群体代表性。见表1。

2.3 两组IL-17A 基因rs2275913、rs4711998位点各基因型及等位基因频率分布比较

两组IL-17A基因rs2275913 位点AA、AG及GG 基因型比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；且其A、G 等位基因频率分布比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组IL-17A基因rs4711998 位点AA、AG 及GG 基因型比较，差异无统计学意义（P＞0.05），且其A、G 等位基因频率分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.4 IL-17A基因rs2275913、rs4711998 位点SNP与CHF的Logistic回归分析

采用非条件二分类反应变量的Logistic 回归分析，自变量为各组基因型，因变量为是否患有心力衰竭，以GG 基因型为参照，可见IL-17A基因rs2275913 位点携带AA 基因型的个体患CHF 的风险是携带GG 基因型个体的4.410 倍。CHF 组IL-17A基因rs2275913（G-197A）位点携带A 等位基因频率高于对照组（P＜0.05）。未发现IL-17A基因rs4711998 位点SNP 与CHF 发病有关（均P＞0.05）。见表3。

表1 CHF 组IL-17A 基因rs2275913、rs4711998 位点与对照组实际、预期基因频率的比较 %

表2 两组IL-17A 基因rs2275913、rs4711998 位点各基因型及等位基因频率分布比较 例（%）

表3 IL-17A 基因rs2275913、rs4711998 位点SNP 与CHF 的Logistic 回归分析参数 例（%）

3 讨论

IL-17A 是一种多效细胞因子，一方面通过募集中性粒细胞与Th17 分泌的其他细胞因子（如IL-6 及肿瘤坏死因子）协同诱导炎症；另一方面其可以产生炎性介质，如刺激上皮细胞和内皮细胞等[11-14]。IL-17A 在多种心血管疾病的发生、发展中起到一定作用，裴芳等[15]研究证实IL-17A基因rs2275913 位点A 等位基因是病毒性心肌炎的易感基因。同样，唐辉等[16]研究证实IL-17A基因SNP 与扩张型心肌病的遗传易感性有关。SHUANG 等[17]发现rs2275913 位点的AA 基因型及A 等位基因的个体与患冠状动脉粥样硬化性心脏病的风险有关联。目前，有研究报道IL-17A基因rs4711998 位点与多种疾病的相关性，如与哮喘、巨细胞动脉炎的发病相关[18-19]。然而，还没有证据支持其在心力衰竭中的作用。哈德温伯格平衡定律应用于理想群体，笔者从理想群体出发并使理论分析结果接近于客观真实群体的情况，从而获得真实群体遗传的一般规律[10]。本研究结果显示，IL-17A基因rs2275913、rs4711998 位点AA、AG 和GG 基因型在CHF 组和对照组中实际与预期基因频率分布比较无差异，表明两组研究样本均具有群体代表性。本研究显示，大部分CHF 患者IL-17A基因rs2275913 位点基因型多为AG 或AA，且携带A 等位基因的频率明显高于对照组，其患病风险也显著增加。本研究结果提示CHF 的发病与IL-17A基因rs2275913 位点SNP 相关，这表明G-197A 的变化导致IL-17A基因表达，扰乱了调节生物效应的机制，致使免疫状态发生改变并在多种刺激诱导下发生心肌损害、心肌纤维化及心室重构。这与SANDIP 等[20]报道的结果不一致，造成这种差异的潜在原因是被调查人群中不同种族、不同地区间突变的差异。

综上所述，IL-17A基因rs2275913 位点多态性可能与CHF 的发病有关，而且该位点可能影响基因的转录和表达。然而，这项研究有几个局限性。首先，本研究由于样本量偏少，其次特定区域的抽样不能反映其他区域的情况。因此本研究仍需进一步扩大样本量，进行多中心、多群体及多位点的前瞻性研究来验证IL-17A基因与CHF 发生、发展的关系。