核桃酚类物质及其生物合成研究进展

盛芳，胡帮燕，金强，吴翠云，罗正荣*

(1.华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，湖北武汉430070；2.塔里木大学植物科学学院)

核桃(JuglansregiaL.)是胡桃科(Juglandaceae)核桃属(JuglansL.)落叶乔木或灌木，大多分布于北半球。中国现有核桃属植物9种，其中以核桃和泡核桃(J.sigillataDode)最为常见。据FAO统计，2017年中国核桃栽培面积48.99万hm2(占世界44.6%)、年产量192.54万t(占世界50.3%)，均居世界第一。

植物多酚(Polyphenols)是以苯酚为基本骨架的多羟基酚类次生代谢产物的总称。核桃多酚类物质主要包括酚酸类、黄酮类、单宁类，其中鞣花单宁是最重要的酚类化合物，还含有没食子酸、鞣花酸、咖啡酸、儿茶素、香豆酸等，在其青皮、内果皮、种皮、种仁中均有分布，不同部位的多酚种类和含量有明显差异。核桃青皮主要含胡桃醌、山奈酚、槲皮素等；核桃叶片内主要含槲皮素和新绿原酸[1]；核桃种仁种皮中主要成分为绿原酸、丁香酸、鞣花酸等[2]。

核桃多酚具有抗氧化活性，不仅防止种仁氧化，对人体也有抗氧化作用，可延缓衰老[3]。现代营养学与药理学研究表明，核桃多酚在健脑益智[4,5]、降低血脂[6]和血糖等方面功效明显[7]。核桃多酚提取物具一定的抗癌[8,9]、杀虫和抑菌作用[10]；对酪氨酸酶活性有抑制作用[11,12]。以核桃青皮为原料可制备染发剂[13]。

核桃酚类物质鉴定及其生物合成途径等研究具有重要的科学意义和应用前景。笔者从植物多酚的种类及特点出发，就核桃多酚的化学组成、定性定量分析和生物合成途径等方面进行综述。

1 核桃多酚的种类及其特点

植物多酚主要包括酚酸类、单宁类、黄酮类等。可溶性多酚主要分布于植物细胞的液泡内，不溶性多酚则是细胞壁结构的组分。核桃中只有少部分酚酸以游离态存在，多数是与纤维素、蛋白、木质素、类黄酮、葡萄糖等结合的形式存在。单宁多元酚是植物体内次生代谢产物之一[14]，能与生物碱、蛋白质、多糖类物质以及金属离子发生沉淀反应，根据其结构不同可分为水解单宁和缩合单宁；王全杰等[15]通过试验证实核桃青皮中单宁属水解类单宁。黄酮醇是植物中常见的黄酮类物质，是主要的核桃酚类成分，具有清除自由基和抗炎活性，预防胰岛素受阻、心血管疾病及消除肥胖的能力(表1)。

表1 核桃多酚的种类和成分

2 核桃多酚的分析技术

2.1 提取和分离纯化

核桃多酚化合物常与蛋白质、多糖等物质通过氨键和疏水键形成稳定的复合物分子，提取多酚常用的提取液有水和有机溶剂。溶剂提取法常借助于超声波、微波、离子液体等辅助提取技术以缩短提取时间和提升产量[21,22]。生物技术手段也是成分提取中较常用的方法之一，主要包括酶解法和微生物发酵法。酶解法具高度专一性、强催化活性和反应条件温和等特点。酶解法与超声波或微波技术结合也可提高提取率[23,24]。超临界萃取法具有萃取速度快、无污染、无化学残留、可在室温下提取分离的优点，目前常用CO2做萃取剂[25]。Regueiro等[22]通过60%丙酮水涡旋1分钟后在冰上超声处理5分钟，并结合LC-LTQ-Orbitrap技术综合鉴定核桃中酚类化合物，根据其保留时间，测量的离子质量碎片数据，初步鉴定了120种化合物，包括可水解和缩合的单宁，类黄酮和酚酸，并新鉴定了8种核桃多酚类物质。

色谱技术常被用来分离和纯化植物有效成分，主要有薄层色谱(TLC)、柱色谱(CC)、气相色谱(GC)[26]和高效液相色谱(HPLC)[27,28]等。马乐等[27]利用NKA-9树脂分离纯化核桃青皮多酚，对吸附条件和洗脱条件优化后，经HPLC鉴定和分析表明，核桃青皮酚类物质主要由原儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、阿魏酸、芦丁等单体组成，其中的表儿茶素、原儿茶素和芦丁含量较高。

2.2 定性和定量

各光谱数据的相互印证是化学成分准确鉴定的必备条件，对已分离纯化的样品可先用熔点、气相色谱和高效液相色谱来证实样品的纯度[29,30]，然后利用红外光谱确定官能团的特征吸收[31]，利用质谱的分子离子峰确定化合物的分子量和分子式[32,33]，利用核磁共振谱分析组成分子的碳氢骨架信息[32]。Liu等[32]通过UHPLC-Q Orbitrap HRMS鉴定了核桃隔膜中200种化合物，包括可水解的单宁，类黄酮，酚酸和醌，其中超过150种首次在隔膜中获得鉴定；使用UHPLC-MS/MS成功定量了21种具有健康促进作用的膳食多酚，总含量为2.88～6.18mg/g；表征和定量了隔膜中具生物活性的化合物。Shi等[30]对不同发育阶段的核桃青皮中酚类含量和抗氧化活性进行分析，4月底至6月初总酚和总黄酮含量下降，此后增加，至8月初再次下降。用HPLC技术分析了13种酚类化合物含量，随季节变化，不同酚类化合物的变化趋势不同，其中胡桃醌含量最高；总酚和总黄酮含量与抗氧化活性密切相关，但单个酚类化合物和抗氧化活性之间的相关性不太显著(具体分析技术见表2)。

表2 核桃多酚的分析技术

3 核桃多酚的生物合成途径及相关基因

核桃中存在丰富多样的酚类物质，以水解单宁(Hydrolyzed tannins,HTs)为主，但核桃单宁的生物合成机制尚不完全清楚[34]。根据已有研究，部分水解单宁由莽草酸途径合成，Muir等[35]研究中强调没食子酸(Gallic acid,GA)的羧基来自莽草酸(Shikimic acid,SA)途径的中间体，没食子酸(GA)是许多植物次生代谢产物的必需前体，特别是没食子单宁和鞣花单宁。Ossipov等[36]研究白桦发现，莽草酸代谢存在质体和细胞质两种途径，脱氢莽草酸的生物合成可能是从细胞质中的莽草酸途径的上游区段中的脱氢奎宁酸进行的，进一步转化为水解单宁，即水解单宁来自莽草酸途径的中间化合物脱氢莽草酸。Muir等[35]将核桃的莽草酸脱氢酶(Shikimate dehydrogenase,SDH)基因过表达到烟草中，显示GA积累增加；通过纯化核桃SDH在大肠杆菌中过表达，并采用反相液相色谱-电喷雾质谱(RP-LC/ESI-MS)联用技术定量和验证GA的生成；研究证明SDH是一种对芳香族氨基酸合成必不可少的莽草酸途径酶，也是GA生产所必需的；GA合成由双功能酶SDH催化。

Xu等[37]首次分离并表征了来自核桃的PAL基因，分析了其在不同组织和胁迫下的表达谱，预测JrPAL可能是一种应激反应基因。Christopoulos和Tsantili[38]研究发现冷应激下PAL的特异性和总活性增加；酚类中2，4-二羟基苯甲酸和原儿茶酸乙酯、4-羟基苯甲酸、2，4-二羟基苯甲酸、丁香酸和香草酸的增加与PAL活性增加一致，而鞣花单宁则基本上不依赖于PAL，原儿茶酸的增加和原儿茶酸乙酯的减少与PAL没有直接关系。Cheniany和Ganjeali[39]通过RT-PCR技术探究核桃体外生根过程中PAL和C4H基因的发育表达模式，以及与槲皮素含量变化之间的关系，研究结果表明，PAL基因表达与槲皮素的变化呈正相关，C4H与核桃根茎的酚类化合物形成无关。可见苯丙烷类代谢途径与酚酸生物合成直接相关(图1)。

4 小结

目前核桃多酚的研究主要集中在定性、定量和生物活性，少数涉及生物合成途径。结合多种光谱分析方法确定核桃多酚以种类丰富、含量各异的多种酚酸和类黄酮的单体为主要组成成分；以水解单宁为主的核桃多酚的合成除莽草酸途径和苯丙烷类途径中个别基因外，其合成机制并不完全清楚。进一步的研究应在现有研究基础上着重核桃多酚代谢路径、成分细化和产品开发研究，从而促进核桃附加值的提高和核桃产业的发展。