基于神经网络模型评价淫羊藿女贞子配伍对衰老大鼠自由基损伤的作用

马紫童 唐秀凤 高莹莹 于萍 王瀚 刘仁慧

摘要 目的：研究大鼠血清氧化调节因子的增龄性改变及平补阴阳中药淫羊藿女贞子的影响作用。方法：8个月龄雄性SD大鼠，随机分为7组，饲养至相应月龄，包括9个月龄组、12个月龄组、15个月龄组、17个月龄组，淫羊藿组、女贞子组、淫羊藿女贞子组（配伍组），以3、6个月龄雄性大鼠为青年对照组。各用药组饲养至15个月龄后开始灌胃给予相应药物2个月。取血清检测以下指标：总抗氧化能力（TT-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、还原型谷胱甘肽（GSH）、一氧化氮（NO）、总一氧化氮合成酶（tNOS）、诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、结构型一氧化氮合酶（cNOS）及8-羟基脱氧鸟苷（8-OHDG）。结果：与青年大鼠比较，17个月龄大鼠血清SOD、GSH、GSH-PX及T-AOC水平显著降低（均P<0.01），NO、tNOS、iNOS、MDA及8-OHDG含量顯著升高（P<0.05或0.01），cNOS差异无统计学意义。与17个月龄大鼠比较，配伍组SOD、GSH、GSH-PX及T-AOC水平显著升高（均P<0.01），NO、tNOS、iNOS、cNOS、MDA及8-OHDG含量均显著降低（P<0.05或0.01）。基于多层感知（Multi-Layer Perceptron，MLP）神经网络模型，结果显示淫羊藿女贞子合用可使17个月龄自然衰老大鼠的上述指标的改变逆转至（10.45±0.87）个月，作用优于淫羊藿、女贞子单用。结论：淫羊藿女贞子配伍延缓衰老的作用与其改善衰老大鼠血清自由基损伤有关。

关键词 自然衰老;淫羊藿/女贞子;自由基损伤;抗氧化作用

Abstract Objective：To study the influence and action of serum oxidation regulating factors in rats and the effects of compatibility of Herba Epimedii and Fructus Ligustrilucidi，which are for even reinforcing-reducing yin and yang.Methods：Male SD rats aged 8 months were randomly divided into 7 groups raised to corresponding months，including 9-month group，12-month group，15-month group，17-month group，Herba Epimedii group，Fructus Ligustrilucidi group，and Herba Epimedii and Fructus Ligustrilucidi compatibility group.3-month and 6-month male rats were used as the youth control group.Each medication group was raised to 15 months of age and started to gavage the corresponding drugs for 2 months.Take serum to test the following indicators：total antioxidant capacity（TT-AOC），Superoxide dismutase（SOD），Malondialdehyde（MDA），glutathion peroxidase（GSH-PX），glutathione（GSH），nitric oxide（NO），total nitric oxide synthase（tNOS），inducible nitric oxide synthase（iNOS），constructive nitric oxide synthase（cNOS），8-hydroxy-2′-deoxyguanosine（8-OHDG）.Results：Compared with the youth mice，the levels of SOD，GSH，GSH-PX and T-AOC were decreased significantly（all P<0.01）in 17 months mice serum，and the contents of NO，tNOS，iNOS，MDA and 8-OHDG were increased significantly（P<0.05 or 0.01），cNOS difference was not statistically significant.Compared with 17 months group，the levels of SOD，GSH，GSH-PX and T-AOC were decreased significantly in the compatibility group.The contents of NO，tNOS，iNOS，MDA，cNOS and 8-OHDG were decreased significantly（all P<0.01）.Based on the study of multi-layer neural network（MLP）model，it was confirmed that the compatibility group could reverse the above-mentioned changes to（10.45±0.87）months old，and the effect was better than that of Fructus Ligustrilucidi and Herba Hpimedii alone.Conclusion：The compatibility of Herba Epimedii and Ligustrum Lucidum can delay senescence.It may be related to the improvement of free radical injury in aging rats.

Keywords Natural aging; Herba Hpimedii/Fructus Ligustrilucidi; Free radical injury; Antioxidation

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.21.010

随着社会的发展、医学的进步，人类平均寿命不断增高，老龄化已成为严重的社会问题[1]。如何延缓衰老，改善老年人生命质量成为世界各国学者的研究重点。衰老自由基学说（Free Radical Theory of Aging，FRTA）是现代医学认识衰老发病机制的重要学说之一，认为在代谢过程中通过许多相互关联的反应产生自由基，其可导致DNA、蛋白质和脂质的损伤及积累，进而导致疾病的发生和机体的衰老[2]。中医学在延缓衰老方面有着丰富的理论与实践经验，从《黄帝内经》起中医学就建立并发展起了各种的衰老学说，其中脏腑虚衰学说尤其是肾虚，肾中阴阳不足占领主导地位[3]，故补肾是延缓衰老的主要治法。具有平补肾中阴阳、补肾填精之功的淫羊藿、女贞子药对源于国家级名老中医李世增教授50余年临床经验筛选，临床常用于治疗衰老相关疾病[4]。前期实验研究证实，淫羊藿女贞子配伍对衰老相关疾病骨质疏松以及慢性肺部疾病哮喘均有显著疗效[5]。本研究基于上述认识，选择检测自然衰老大鼠血清中相关氧化调节因子的含量为研究切入点，并采用不同月龄自然生长大鼠模型建立神经网络模型，探讨中药淫羊藿女贞子单用及配伍对血清氧自由基损伤的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级健康雄性SD大鼠，3个月龄（8只）、6个月龄组（8只）、8个月龄（56只）由北京维通利华实验动物技术股份有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2016-0001，动物伦理号：AEEI-2016-178。大鼠置于SPF级动物房内饲养，室温（23±2）℃，湿度为50%±5%，照明昼夜明暗交替时间为12 h/12 h，自由饮水、进食。

1.1.2 药物 中药材酒女贞子（北京盛世龙药业有限公司，批号：1709025）;中药材炙淫羊藿（北京人卫中药饮片厂，批号：17082301）。

1.1.3 试剂与仪器 谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathion Peroxidase，GSH-PX）测定试剂盒（货号：A005）、微量还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）测定试剂盒（货号：A006-2）、一氧化氮合成酶（NOS）分型测试盒（Total Antioxidant Capacity，tNOS;Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS;Constructive Nitric Oxide Synthase;cNOS）（货号：A014-1-1）、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）测定试剂盒（货号：A013-2）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（货号：A003-1）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）测定试剂盒（货号：A001-3）、总抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）检测试剂盒（货号：A015-1）均购于中国南京建成生物工程研究所;8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHDG）酶免试剂盒（BLUE GENE公司，货号：E02H0007）;三用电热恒温水箱（天津市泰斯特仪器有限公司，型号：SHHW21.420AⅡ）、高速组织匀浆机（IKA公司，德国，型号：T10）、多功能基因蛋白检测仪（Molecular Devices公司，美国，型号：SpectraMax i3D）。

1.2 方法

1.2.1 分组方法 8个月龄大鼠56只随机分为7组，包括9个月龄组、12个月龄组、15个月龄组、17个月龄组、淫羊藿女贞子组（配伍组）、淫羊藿组、女贞子组，每组8只。SPF级3个月龄（8只）、6个月龄（8只）作为青年对照组。

1.2.2 给药方法 3、6、9、12、15个月龄组不给予药物治疗。17个月龄组与用药各组正常饲养至15个月龄后开始灌胃给药，1次/d，连续给药2个月。17个月龄组、淫羊藿组、女贞子组、配伍组分别给予饮用水5 mL/kg、淫羊藿煎剂2 g/kg、女贞子煎剂1.5 g/kg、淫羊藿女贞子（4∶3）煎剂3.5 g/kg（相当于临床等效剂量）体质量灌胃。

1.2.3 取材及检测 3、6个月龄组大鼠购买后适应环境1周后处死;9、12、15个月龄组饲养至相应月龄后处死;其他组饲养至17个月龄后处死。禁食16 h后，腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，离心取血清。采用比色法检测大鼠血清tNOS、iNOS、cNOS、GSH-PX、T-AOC;微板法检测GSH、NO;WST-1法检测SOD;TBA法检测MDA;酶免法检测血清8-OHDG水平。以上检测均按照测试盒说明书进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0 for Windows对研究数据进行统计分析，数据采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差齐性检验及单因素方差分析，根据方差齐性检验结果选择LSD（方差齐）或Tamhane′s T2（方差不齐），综合分析采用神经网络分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血清中T-AOC、GSH-PX及GSH水平的增龄性改变及淫羊藿女贞子的影响 大鼠血清T-AOC、GSH-PX及GSH值分別在9、3、6个月龄处达到峰值，之后随着月龄的增加而逐渐降低。与17个月龄组大鼠比较，淫羊藿、女贞子单用及配伍组血清T-AOC、GSH含量均显著升高（P<0.01或P<0.05）;淫羊藿及配伍组血清GSH-PX活力显著升高。见表1、表2。

2.2 大鼠血清中NO和NOS的增龄性改变及淫羊藿女贞子的影响 不同月龄组大鼠血清NO、tNOS及iNOS值随着月龄的增加而出现逐渐增加的趋势，cNOS值无增龄性改变。与17个月龄组比较，各给药组大鼠血清中NO、tNOS、iNOS的含量均显著减少（P<0.01或P<0.05）;女贞子组及配伍组大鼠血清cNOS含量均显著减少（P<0.01或P<0.05）。配伍组大鼠对血清NO影响与女贞子组差异有统计学意义（P<0.01），对tNOS的影响与淫羊藿、女贞子组比较，差异均有统计学意义（均P<0.01）。见表3、表4。

2.3 大鼠血清SOD、MDA、8-OHDG的增龄性改变及淫羊藿女贞子的影响 不同年龄组大鼠血清SOD含量随着月龄的增加而逐渐降低;而MDA和8-OHDG含量出现逐渐升高的趋势。与17个月龄组比较，淫羊藿、女贞子单用及配伍均能显著升高血清SOD水平，降低血清MDA及8-OHDG水平。此外配伍组对血清SOD的影响与女贞子组比较，差异有统计学意义（P<0.01），对MDA的影响较淫羊藿、女贞子单用组差异均有统计学意义（均P<0.05）。见表5、表6。

2.4 基于神经网络模型评价淫羊藿女贞子延缓衰老的综合影响作用 对6个不同月龄组的10项检测指标应用MLP神经网络分析，其中训练样本33个，测试样本15个，保持样本5个，得到神经网络模型包括输入层神经元个数10个，隐藏层神经元个数5个，输出层神经元个数6个，得到的模型训练样本百分比错误预测1.3%，测试样本百分比错误预测3.2%。利用此模型对给药各组样本的10项数据进行预测，与17个月龄组的预测值（16.87±0.23）个月比较，得到配伍组预测月龄为（10.45±0.87）个月、淫羊藿组预测月龄为（12.79±0.84）个月、女贞子组预测月龄为（13.73±1.15）个月均显著降低（均P<0.01）。与淫羊藿、女贞子单用比较，配伍组预测月龄显著性降低（均P<0.01）。根据输入生理指标对网络的影响程度。见图1。可知GSH-PX，SOD、T-AOC、tNOS、NO、iNOS、GSH均是本神经网络模型中较为重要的影响因素（标准化的重要性>50%）。见表7，图1。

3 讨论

衰老是指机体发育至成熟以后，随着年龄增长，机体的结构形态、生理功能等出现一系列退行性变化[6]。现代医学对衰老机制已经形成多种学说，其中自由基学说是最具代表性的衰老学说之一。这种理论认为：机体内许多物质代谢中产生过氧化的自由基，自由基反应活跃且易引发连锁反应，导致机体损伤，如引起脂质过氧化、形成脂褐素、损伤蛋白质使之变性、破坏细胞膜导致细胞死亡等[7]。活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）具有不成对电子，称为自由基，生物体内主要有超氧阴离子、羟基、NO等。ROS作为稳态代偿反应的激活剂，随着年龄的增长而增加，以通过或各种防御机制刺激细胞增殖来维持机体内环境稳态。然而，从一定的限度开始，ROS作为刺激因子加重机体的衰老相关的损伤[8]。ROS的浓度是由ROS的生产速率与各种抗氧化化合物和酶的清除速率之间的平衡决定的，血管系统中具有抗氧化酶系统，该系统是主要的防御活性氧对机体的损害[9-10]。SOD，过氧化氢酶（CAT），GSH-PX是该系统重要的抗氧化酶，可以清除体内自由基。GSH含有一个活泼的巯基-SH，能够与自由基结合，而发挥抗氧化能力。MDA是脂质过氧化的重要产物，是衡量体内自由基代谢的指标之一，MDA的积累过多，可導致细胞、组织、器官的损伤。

在哺乳动物中，ROS主要来源是线粒体呼吸、细胞色素P450、NADPH氧化酶、NO合成酶等。NO是体内重要的信使分子和神经递质，参与神经递质传递、血压调节、免疫及炎性反应等，高浓度的NO可发挥毒性作用，破坏线粒体正常功能，引起细胞凋亡[11]。NOS是NO合成过程中唯一的限速酶，其活性可直接影响NO的生成量与其生物学效应。NOS分为神经型NOS、内皮型NOS和iNOS。其中前二者可统称为结构型NOS（cNOS）[12-13]。cNOS活性受细胞内钙浓度的调控，而iNOS可通过细胞因子、脂多糖和其他免疫相关因子的刺激诱导表达[14]。ROS过量产生可阻碍核和线粒体DNA修复，并氧化损伤DNA产生8-OHDG，造成细胞功能改变，最终引起组织器官功能减退[15]。因此8-OHDG可作为氧化损伤标记物，代表细胞氧化损害严重程度。

阴阳失调说认为阴阳之间的变化是一切事物运动变化的根据，同时也是生命生长、发育、衰老以至死亡的根本原因。《素问·阴阳应象大论》云：“能知七损八益，则二者可调，不知用此，则早衰之节也”，明确指出人的衰老同阴阳虚衰而导致的阴阳失调有关[16]。然而随着年龄增加，肾阴、肾阳亏虚的逐渐加重，出现阴阳的偏盛偏衰或阴阳两衰，这是导致衰老的重要因素。淫羊藿、女贞子是常用的延缓衰老的补肾中药，二者配伍可平补肾中阴阳，是国家级名老中医李世增教授常用于治疗衰老相关疾病的基本药对组合。

本研究通过检测自然衰老大鼠血清中SOD、GSH、GSH-PX、T-AOC、NO、tNOS、iNOS、cNOS、MDA及8-OHDG含量，观察大鼠血清内抗氧化能力。结果显示，17个月龄老年大鼠较青年大鼠（3、6个月龄）血清中SOD、T-AOC、GSH-PX及GSH水平显著降低，NO、tNOS、iNOS、MDA及8-OHDG含量显著升高，提示17个月龄大鼠抗氧化能力下调，体内自由基累积，与文献研究的衰老模型抗氧化能力减弱一致。用药各组对不同指标的作用不等。淫羊藿、女贞子单用及配伍均可提高衰老大鼠血清T-AOC、SOD和GSH水平，并降低NO、tNOS、iNOS、MDA、8-OHDG水平;淫羊藿单用和配伍组能显著升高血清GSH-PX水平。基于神经网络模型综合评价了淫羊藿、女贞子单用及配伍的作用，评价淫羊藿、女贞子单用及配伍对衰老大鼠血清上述与自由基损伤相关10个指标的综合作用，与17个月龄衰老大鼠比较，差异有统计学意义（P<0.01）;且配伍组的作用优于2药的单用，证实了配伍用药的优越性及合理性。

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（2019-09-21收稿 责任编辑：王杨）