Sysmex HISCL-5000全自动血凝仪检测TAT、TM、PIC、tPAIC项目的性能验证

李 雯，张 磊,雷 娜，张 雯，魏 伟，徐 阳

西安交通大学第二附属医院检验科，陕西西安 710004

凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)、纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物(PIC)、血栓调节蛋白(TM)、组织纤溶酶原激活物/纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物(tPAIC)是目前新型的止血与血栓系统早期标志物。TAT是凝血酶与其主要抑制剂抗凝血酶按1∶1比例结合形成的复合物，可用于评估体内凝血系统的激活情况。TM是主要存在于血管内皮细胞上的高亲和性凝血酶受体，通过与凝血酶结合，形成凝血酶-TM复合物，进而活化蛋白C，发挥抗凝作用。t-PAIC是血管内皮细胞释放到血液中的组织纤溶酶原激活物t-PA与其生理性抑制因子纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)1∶1结合形成的复合物。PIC是活化的纤溶酶与α2-抗纤溶酶抑制物1∶1结合形成的复合物[1]。因此，TAT和TM是凝血系统标志物。t-PAIC和 PIC是纤溶系统标志物。t-PAIC和TM是血管内皮系统标志物。检测TAT、TM、PIC、tPAIC对于血栓性疾病、心肌梗死、脑血管疾病、弥散性血管内凝血的早期诊断、溶栓治疗、外科手术以及抗凝药物的监测都具有指导意义。 本次试验根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)系列指南文件对使用Sysmex HISCL-5000全自动凝血仪及配套试剂对TAT、TM、PIC、tPAIC检测的性能进行了验证，内容包括批内精密度、日间精密度、线性、检出限、携带污染率、参考值范围验证。现报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源 选择健康体检者，参照 CLSI H21-A5文件处理血浆[2]，用0.109 mmol /L 柠檬酸钠抗凝管采集患者的静脉血1.8 mL，1 500×g离心10 min，分离出乏血小板血浆，要求标本无溶血、凝固、乳糜现象，红细胞比容<55%。

1.2仪器与试剂 全自动血凝仪(型号：Sysmex HISCL-5000)及配套试剂。

1.3验证方法

1.3.2线性验证 参照EP6-A[4]文件，选取2个高浓度水平的混合血浆，分别使用HISCL标本稀释液稀释5个阶段，每个稀释后的标本测定3次取均值作为一个点，将5对实测值与理论值作直线回归，得到回归方程Y=aX+b和相关系数r2验证线性范围。回归方程斜率在1±0.05 范围内，相关系数r2≥0.95判定为合格。

1.3.3检出限验证 参照EP17-A[5]文件中的要求，空白检出限(LOB)：选稀释液作为空白样品连续测定10次；样本检出限(LOD)选择取枸椽酸钠抗凝样本，取出血浆与HISCL Wash配制浓度分别为100%、80%、60%、40%、20%、10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0的11个系列样本，每一样本连续测定10次；分别计算每一样本的均值、标准差、变异系数、百分偏差，然后得出LOB、LOD。

1.3.4参考区间验证 参考C28-A2文件[6]，随机收取20例健康体检者血浆，排除影响血凝检测结果的因素(如服用抗凝药物，避孕药等干扰因素的人群)，测定标本并计算R值(R= 结果落在参考范围内的样本数/总的实验样本数)，要求 R≥0.9，即为验证通过。

1.3.5携带污染率验证 参照CLSIH57-A文件[7],高值样本污染：将低值样本(N)置1和3 位置，高值样本(A)置于2位置，每个样本测3次，记录结果：N1、N2、N3、A1、A2、A3、N4、N5、N6。按照公式，携带污染率=[N4-均值]/均值，均值指N1、N2、N3平均值。尚未查到对TAT、TM、PIC、tPAIC检测携带污染率有要求的指南性文件，仅有相关血凝仪性能验证文献[8-9]报道各项目CV<10%。

1.4统计学处理 采用 Excel2003进行数据统计分析。

2 结 果

2.1精密度验证结果 厂家试剂盒说明书要求：要求TAT、TM、PIC、tPAIC批内不精密度和日间不精密度的CV<15%，验证结果符合要求,见表1。

2.2线性验证结果 TAT线性验证试验理论值和实测值的回归方程为Y=0.994 7X+0.291 6，r2=0.999 9,TM线性验证试验理论值和实测值的回归方程为Y=0.999 1X-0.145 8，r2=0.999 7；PIC线性验证试验理论值和实测值的回归方程为Y=1.028 5X-0.053 1,r2=0.996 8；tPAIC线性验证试验理论值和实测值的回归方程为Y=1.024 2X+0.323 3,r2=0.995 9，均符合线性回归方程的斜率在1±0.05范围内及r2≥0.95的要求，验证结果表明TAT、TM、PIC、tPAIC实测值和理论值之间线性关系良好。

2.3检出限验证结果 TAT最低检出限0.006 8 ng/mL，TM最低检出限0.067 1 TU/mL，PIC最低检出限0.001 2 μg/mL，tPAIC最低检出限0.026 5 ng/mL。均小于厂家说明书给出的最低检出限。

表1 精密度验证结果

2.4参考区间验证结果 20例健康人TAT、TM、PIC、tPAIC检测结果100%在厂家说明书提供的参考范围内(TAT参考范围<4.0 ng/mL，TM参考范围3.8～13.3 TU/mL，PIC参考范围<0.8 μg/mL，tPAIC男性<17 ng/mL，tPAIC女性<10.5 ng/mL)，符合厂家要求，验证通过，见表2。

2.5携带污染试验结果 TAT高值对低值的污染所引起的相对偏差为 0.75%；TM高值对低值的污染所引起的相对偏差为-0.64%；PIC高值对低值的污染所引起的相对偏差为1.15%，tPAIC高值对低值的污染所引起的相对偏差为1.22%。携带污染率可接受，见表3。

表2 参考值验证

表3 高值样本对低值样本的携带污染率(%)

3 讨 论

作为新型止血血栓系统标志物，TAT、TM、PIC、tPAIC涵盖了止血与血栓系统中的三大方面。TAT是凝血酶生成标志物，正常血浆中半衰期较短，一旦TAT持续呈现出高值，则意味着血液中有凝血酶生成，提示血栓形成倾向，可以作为血栓前状态的早期标志物。TM稳定表达分布在膜表面和血浆中，当人体正常的内皮细胞发生病变或受损时，常引起TM的表达分泌异常，因此TM被视为内皮细胞损伤的标志物。而PIC是反映体内纤溶系统激活的标志物，预示血栓正在形成。tPAIC是最重要的纤溶和凝血系统平衡的调节者，提示血栓进行时，导致血栓原发病因未去除。因此，在凝血紊乱引起血栓性疾病甚至DIC时，新型标志物的联合检测具有极其重要的价值。血栓性疾病是一种起病隐匿，发病突然致死致残率较高的疾病，目前我国血栓性疾病发病率高达1‰，病死率可达5% ～ 10%[10]。造成血栓性疾病的高漏诊率和高误诊率的原因如下，一是大多数静脉血栓没有症状，二是缺乏早期的实验室指标。新型标志物的出现弥补了血栓性疾病早期实验室诊断的空白。一项应用凝血标志物诊断创伤骨科术后静脉血栓形成的病例对照研究表明，TAT、TM、PIC、tPAIC检测有助于早期预测创伤创伤骨科术后静脉血栓形成，且优于D-二聚体[11]。也有文献报道PIC和与tPAIC许多心血管疾病密切相关[12]，PIC和与tPAIC是心血管疾病相关标志物之一。同时对于危重症凝血紊乱合并弥散性血管内凝血DIC患者，新型标志物可以更早的提示前DIC状态。有研究表明，在前DIC期，TAT，PIC等在前DIC发生显著变化[13]。目前，日本已经将TAT的增加添加进了DIC诊断标准中作为辅助检查的项目，国际血栓止血学会、标准化委员会(ISTH/SSC)的诊断标准(2001年)中也将其作为“non-overt DIC”的特异性诊断项目进行了评分[14]。

不仅对于血栓性疾病的诊断，在血栓性疾病的治疗与监测方面，新型标志物也有极为重要的意义。有文献报道急性心肌梗死冠状动脉内t-PA溶栓同时行肝素抗凝的患者，溶栓后120 min血浆TAT水平大于6 ng/L可预测溶栓失败和血栓再闭塞；血浆TAT小于6 μg/L时,对鉴别血管持续开通和未成功溶栓治疗的灵敏度和特异度度分别为92.5%和93.3%,故TAT也可作为观察溶栓治疗疗效的指标[15]。

因此，本院引进Sysmex HISCL-5000开展TAT、TM、PIC、tPAIC新型标志物检测，能更好地辅助临床对于血栓性疾病、心肌梗死、脑血管疾病、DIC的早期诊断，以及对外科手术、抗凝药物、溶栓治疗的监测。Sysmex HISCL-5000是目前世界上唯一使用高敏化学发光检测凝血项目的仪器。与传统ELISA方法耗时长，干扰因素多，批间差异大相比，Sysmex HISCL-5000以化学发光酶免疫测定法为原理，采用碱性磷酸酶作为催化剂，以显示出很强发光强度CDP-Star作为化学发光基质，具有灵敏度，可到达10～21 mol/L，检测速度快，特异度高的特点。为了验证厂家对Sysmex HISCL-5000所宣称的性能，本次试验参考CLSI系列指南文件对使用Sysmex HISCL全自动凝血仪及配套试剂对TAT、TM、PIC、tPAIC检测项目的性能进行了验证。实验室如果使用的检测系统是封闭系统，则只需做包括：精密度、线性实验、参考区间、检测限、携带污染率等基本的参数。 精密度是指规定条件下所获得独立测量结果的接近程度，体现检测系统的重复性，精密度分为批内精密度和日间精密度，是性能验证的基础。在线性评价验证中，采用了二元一次直线回归作为分析线性的EP6-A[4]评价方法，保证了结果的准确性和代表性。检测限是分析测试的重要指标，指某一分析方法在给定的可靠程度内可以从样品中检测待测物质的最小量，确定检测限时，仪器的空白值是重要依据。检测限体现了仪器灵敏度，可以更好地了解仪器的测量范围。参考区间的验证中，在体检服务的健康人群总体中抽出20个参考个体，验证了小样本参考值和说明书参考值之间的可比性。携带污染率是确定高浓度样本对低浓度样本的影响。通过本次实验数据分析，Sysmex HISCL-5000全自动凝血仪及配套试剂对TAT、TM、PIC、tPAIC项目检测的性能符合仪器厂家所宣称的性能指标，能够为临床提供准确的检测报告。

目前对于TAT、TM、PIC、tPAIC的性能验证鲜见发表，对于血栓新型标志物，希望各级实验室能够参考指南规范化开展，从而保证检验结果准确、可靠，更好地为临床提供参考。