基于妊娠期糖尿病血糖控制效果对Klotho 基因表达影响的研究*

吴昌志 余星火

（江西省妇幼保健院检验科 南昌330006）

妊娠期糖尿病一般是指在妊娠后发生或妊娠后首次发现的糖耐量异常，是妊娠期常见的并发症，世界各地的发生率为5%～10%[1]。随着我国经济飞速发展，人们生活方式发生改变，二孩政策全面开放，妊娠期糖尿病发病率明显升高[2]。妊娠期糖尿病患者常无明显自觉症状，分娩结束后，多数患者血糖会恢复，部分患者产后会发展为2 型糖尿病。然而妊娠期糖尿病对孕妇及胎儿都可产生不良影响，对母体可导致感染、产程延长、难产、羊水增多、妊高征等，对胎儿可导致巨大胎儿、宫内发育迟缓、死胎、新生儿呼吸窘迫等[3～4]。因此，积极控制妊娠期糖尿病对改善妊娠结局具有重要意义。Klotho 蛋白是一种新发现的抗衰老蛋白，参与机体多种生理、病理过程[5]。有研究发现Klotho 蛋白可参与机体能量代谢过程，我们前期的研究数据也发现Klotho 蛋白与糖化血红蛋白呈负相关，然而Klotho 蛋白与高血糖之间的因果关系及相关机制尚无相关研究。本研究在体内外模型中探讨了Klotho 蛋白在妊娠期糖尿病高血糖代谢的分子机制，为妊娠期糖尿病预防与治疗提供新的潜在治疗靶点。现报道如下：

1 材料与方法

1 一般资料 本研究招募研究对象103 例，均为2018 年11 月～2019 年10 月在江西省妇幼保健院定期做门诊孕期检查的妊娠人群，年龄22～48 岁，平均年龄（28±6.0）岁；孕妇于孕24～28 周行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），对阳性人群进行相应治疗，并在孕32～35 周测量所有研究对象的糖化血红蛋白（HbA1c），依据糖化血红蛋白指标控制情况分为血糖控制不达标组（HbA1c＞6.5%）56 例，血糖控制达标组（HbA1c＜6.0%）47 例。所有入组的孕妇均为中低危人群，单胎妊娠，无高血压、心血管疾病、肝病、肾病史，近期无外伤手术史；排除急慢性感染、呼吸系统和泌尿生殖系统炎症疾病史，其他产科并发症和合并症。妊娠期糖尿病诊断标准：采用美国糖尿病协会推荐的OGTT 试验，孕妇在孕24～28 周口服75 g 葡萄糖后，分别采集空腹，口服葡萄糖1 h 和2 h 标本进行血糖检测，3 次血糖值分别达到或超过5.1 mmol/L、10.0 mmol/L、8.5 mmol/L 则判定为妊娠期糖尿病。

1.2 血清Klotho 蛋白水平检测 采用人α-Klotho和β-Klotho 蛋白酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒进行检测，分别购自钦城生物有限公司、百奥莱博有限公司，操作步骤按照商品试剂盒说明书进行。

1.3 HEK293 细胞培养 细胞培养基为DMEM（Gibco）加100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素，培养环境37℃，5%二氧化碳（CO2），高糖组采用终浓度为28 mmol/L 的葡萄糖，低糖组采用终浓度为5.5 mmol/L 的葡萄糖，细胞培养基每隔24 h 换液，培养48 h、72 h、96 h、120 h 收获细胞。培养操作严格无菌操作，避免支原体等微生物感染。

1.4 逆转录-聚合酶链反应法 （RT-PCR） 检测α-Klotho 和β-Klotho 信使核糖核酸（mRNA）表达水平获取细胞经核糖核酸（RNA）提取，互补脱氧核糖核酸（cDNA）逆转录后进行RT-PCR 实验，聚合酶链反应（PCR）条件：α-Klotho 和β-Klotho 都采取变性95℃，15 s；退火60℃，15 s；延伸70℃，20 s，循环35 个；然后72℃，10 min。GAPDH 为内参基因，其中α-Klotho 引物GCTCTCAAAGCCCACATACTG （前引物），GCAGCATAACGATAGAGGCC（后引物）；β-klotho引物TTCTGGGGTATTGGGACTGGA（前引物），CCATTCGTGCTGCTGACATTT（后引物）；GAPDH引物GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT（前引物），GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG3'（后引物）。

1.5 统计学处理 数据处理采用SPSS17.0 统计学软件，计数资料以%表示，采用χ2检验，计量资料以（±s）表示，采用t检验，非正态分布变量以四分位间距表示而后进行分析，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 妊娠期糖尿病血糖控制达标与不达标组α-Klotho 和β-Klotho 蛋白水平比较 血清α-Klotho 和β-Klotho 蛋白表达水平在妊娠期糖尿病血糖控制不达标组明显低于达标组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组妊娠期糖尿病血清α-Klotho 和β-Klotho 蛋白水平比较（±s）

表1 两组妊娠期糖尿病血清α-Klotho 和β-Klotho 蛋白水平比较（±s）

注：妊娠期糖尿病不达标组与达标组α-Klotho 蛋白水平相比较，*P＜0.05；妊娠期糖尿病不达标组与达标组β-Klotho 蛋白水平相比较，#P＜0.05；妊娠期糖尿病不达标组与达标组HbA1c 水平相比较，△P＜0.05。

组别 n HbA1c（%） α-Klotho（pg/ml） β-Klotho（pg/ml）不达标组达标组56 47 7.91±0.52△5.04±0.24 469±7.69*604±9.89 99±3.68#169±5.91

2.2 HEK293 细胞在不同血糖水平培养条件下α-Klotho mRNA 和β-Klotho mRNA 表 达 水 平28.0 mmol/L 组各检测时间点HEK293 细胞α-Klotho 和β-Klotho mRNA 表达水平明显低于5.5 mmol/L 组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同血糖水平培养条件下α-Klotho mRNA 和β-Klotho mRNA 表达水平

3 讨论

随着我国经济高速发展，人们生活条件改善，以及最近二孩政策放开，妊娠期糖尿病发病率进入了一段快速增长期[6]。研究发现，决定妊娠结局和母儿预后的因素是整个妊娠期间血糖的控制情况，而非某一时间点的血糖是否达标[7]。血糖动态监测是评估妊娠期血糖管理方案有效性的手段，但不定期的检测血糖给孕妇生理、精神、经济都带来了不可小觑的影响，因此，血糖监测新标志物的研究十分迫切。之前有研究发现Klotho 蛋白可参与机体能量代谢过程，妊娠期糖尿病是一组以血糖升高、血糖利用障碍为特征的代谢性疾病，Klotho 蛋白是否与妊娠期糖尿病高血糖相关及作用机制尚无相关研究[8]。本研究发现血清α-Klotho 和β-Klotho 蛋白表达水平在妊娠期糖尿病血糖控制不达标组明显低于达标组，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示Klotho 蛋白参与长期的糖代谢平衡过程，Klotho 蛋白有可能可用于妊娠期糖尿病的治疗监测。

现研究已经证实，高血糖可诱导数种细胞产生活性氧并在组织蓄积，从而导致组织细胞损伤。其具体机制一方面与活性氧直接损失细胞DNA、碳水化合物和蛋白质分子有关，另一方面可能与活性氧激活细胞应激敏感性通路相关[9～10]。本研究在体外以HEK293 细胞为研究对象，发现经高血糖培养48 h、72 h、96 h、120 h 后HEK293 细胞28.0 mmol/L 组α-Klotho mRNA 和β-Klotho mRNA 表达水平明显低于5.5 mmol/L 组，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示高血糖是导致Klotho 表达降低的原因。因此，对妊娠期糖尿病患者严格控制血糖可阻止Klotho 基因表达水平降低，进而减少不利于新生儿和妊娠的风险。

综上所述，妊娠糖尿病的发病率持续升高及高血糖对妊娠结局和母儿预后均有明确不良影响。将妊娠期血糖控制于正常水平有利于减少不良妊娠结局发生，但目前的控制现状仍有待提升，面对这一严峻挑战，我们应在现有指南的基础上，继续挖掘一批新的标志物用于规范、诊断、监测和治疗妊娠糖尿病，将患者血糖控制到正常水平，同时不断加强妊娠期母儿产后远期随诊工作。