系统性红斑狼疮患者外周血CD3-CD16+CD56+NK细胞水平变化的临床意义

仲华 王朝辉 林志强 戴许阳 薄德映 王亚南 张磊 翟志佳 焦路阳

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种常见可累及多系统损伤的免疫性疾病，自身抗体形成、补体系统激活、炎症细胞浸润及免疫复合物沉积是其主要病理变化，免疫异常是SLE 发生的重要原因［1］。当前研究表明，SLE患者存在多种免疫调节机制的异常，自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）介导的固有免疫在其中占据重要地位［2］。NK 细胞表面有多种非特异性抗原受体，可识别并杀伤病毒感染细胞及肿瘤细胞。有学者推断，NK 细胞可能可通过介导免疫耐受丧失、免疫效应引起组织病理损伤从而参与SLE 发病及进展中的所有过程，分析NK 细胞在SLE 患者中的水平变化并探讨其与SLE 发生、发展、病情的关系可为SLE 发病机制的研究提供理论支持，也可为SLE 病情评估提供新思路［3-4］。CD3-CD16+CD56+NK 细胞是NK 细胞的主体，本研究以CD3-CD16+CD56+NK 细胞为主要研究指标，分析其在SLE 患者中的表达水平及与患者疾病活动度的相关性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年3月至2019年6月本院风湿免疫科及肾内科收治的145 例SLE 患者作为研究对象。纳入标准：符合美国风湿学会制定的SLE 诊断及分类标准［5］；临床资料及实验室生化指标资料完整；自愿加入本研究并签署同意书。排除标准：合并感染性疾病者、恶性肿瘤、血液系统疾病、心血管疾病者；合并其他系统性自身免疫病者；近期有输血史者；非SLE 所致精神病患者。对照组为同期查体的100 例健康体检者，对照组受试者排除SLE 疾病，经详细体格检查及病史、家族史问询，无自身免疫性疾病及其他慢性基础疾病。

SLE 组患者男性10 例，女性135 例，年龄25～44 岁，平均（35.12±9.45）岁，根据SLE 疾病活动性指数（SLE disease activity index，SLEDAI）评分［6］，处于活动期（SLEDAI≥5 分）患者57 例，非活动期（SLEDAI＜5 分）患者88 例。对照组男性7 例，女性93 例，年龄22～46 岁，（35.01±9.35）岁。SLE 患者及对照组受试者性别组成及年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准，患者及对照组受试者知情并签署同意书。

1.2 方法

1.2.1 资料收集

收集SLE 患者临床资料，主要包括性别、年龄、补体C3、补体C4、C 反应蛋白（C reactive protein，CRP）、血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、抗c1q 抗体、抗dsDNA 抗体水平，这些指标均由本院检验科检验。

1.2.2 NK 细胞计数

SLE 患者于入院当日采集晨起空腹静脉血，对照组于查体当日采集，采用EDTA 抗凝处理，将抽取的抗凝外周静脉血1 mL 置入BD Trucount 绝对计数管内；取20 μL 流式细胞仪-6 色试剂加至试剂管底部，加入50 μL 抗凝全血，充分混匀并在室温、避光条件下孵育15 min，加入450 μL BD FACS 溶血素充分混匀，避光孵育15 min；采用mindray 公司BriCyte E6 型流式细胞仪进行检测，MRFlow 软件进行亚群计数。流式细胞仪-6 色试剂（包括小鼠抗人CD3-FITC、小鼠抗人CD16-PE、小鼠抗人CD56-PE、小鼠抗人CD4-PE-Cy7、小鼠抗人CD8-APC-Cy7、小鼠抗人CD45-Per CP-Cy5.5、小鼠抗人CD19-APC）购自BD 生物科技有限公司。

1.3 统计学处理

采用SPSS 18.0 进行数据统计分析，计数资料以n（%）表示，组间比较行χ2检验；符合正态分布的计量资料以（±s）表示，行独立样本t检验，不符合正态分布的计量资料以中位数±四分位数间距［M，（P25%～P75%）］表示，采用Mann-Whitey秩和检验，采用Pearson相关检验分析指标相关关系，采用Logistic多因素回归分析SLE 患者活动度与临床指标之间的关系，绘制受试者特征工作曲线（ROC曲线）分析指标评估SLE 活动度的价值，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLE 患者及对照组受试者CD3-CD16+CD56+NK 细胞水平比较

对照组受试者CD3-CD16+CD56+NK 细胞计数、百分比分别为［401（228，645）］个/μL、［19.24（9.88，22.85）］%，SLE 组分别为［152（66，202）］个/μL、［11.24（4.71，15.96）］%，组间比较差异均具有统计学意义（U=22.456、19.653，P＜0.05）。

2.2 活动组及非活动组患者临床参数及CD3-CD16+CD56+NK 细胞水平比较

活动组患者补体C3、C4 水平及CD3-CD16+CD56+NK 细胞计数、百分比均低于非活动组，差异具有统计学意义（P＜0.05），ESR、CRP、抗dsDNA抗体、抗C1q 抗体水平高于非活动组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 入组受试者活动性指标及CD3-CD16+CD56+NK 细胞水平比较Table 1 Comparison of activity index and LEVELS of CD3-CD16+CD56+NK cells in enrolled subjects

2.3 CD3-CD16+CD56+NK 细胞水平与活动性指标简单相关关系

Pearson相关性分析示，CD3-CD16+CD56+NK细胞水平与SLEDAI、CRP 水平呈负相关（P＜0.05），与补体C3、C4 水平呈正相关（P＜0.05）。见表2。

2.4 SLE患者活动度与临床指标之间的相关性分析

以SLE 活动度作为因变量，以患者临床参数作为自变量，Logistic多因素分析显示补体C3、ESR、抗dsDNA 抗体、CD3-CD16+CD56+NK 细胞计数及百分比与SLE 活动度独立相关（P＜0.05）。见表3。

表2 CD3-CD16+CD56+NK 细胞水平与活动性指标简单相关关系Table 2 Simple correlation between the level of CD3-CD16+CD56+NK cells and activity index

表3 SLE 患者活动度与临床指标之间的相关性分析Table 3 Correlation analysis between SLE patients'activity and clinical indicators

2.5 CD3-CD16+CD56+NK 细胞水平对SLE 活动度的评估价值分析

ROC曲线示，CD3-CD16+CD56+NK 细胞计数及CD3-CD16+CD56+NK 细胞百分比评估SLE 活动度的曲线下面积分别为0.752（95%CI：0.674～0.829）、0.794（95% CI：0.727～0.865），当截点值为144.08个/μL（敏感度：68.2%、特异度75.4%）、11.44%（敏感度：62.6%、特异度76.5%）时，约登指数最大（分别为0.436、0.391）。见图1。

图1 CD3-CD16+CD56+NK 细胞水平评估SLE 活动度受试者特征工作曲线Figure 1 Receiver characteristic working curve of CD3-CD16+CD56+NK cell level to assess SLE activity

3 讨论

NK 细胞归属于固有淋巴细胞，其前体为造血干细胞，在骨髓中分化后进入外周血。NK 细胞的主要生物学特点为可直接杀伤感染细胞或肿瘤细胞而无需抗原激活，因此其在特定情况下也可直接杀伤靶细胞［7］。除细胞杀伤作用，NK 细胞也可分泌多种趋化因子及细胞因子，调节免疫反应。SLE 作为一种复杂的自身免疫性疾病，在自身抗体形成、补体激活、免疫复合物沉积及炎症细胞浸润过程中均有NK 细胞的参与，目前已有较多研究报道了SLE 患者可伴有NK 细胞计数的减少［8-9］。本研究结果提示CD3-CD16+CD56+NK 细胞可能参与SLE 发病的过程。既往有研究认为，NK 细胞在不同的自身免疫性疾病中可出现不同的表现［10-11］。本研究中所研究的CD3-CD16+CD56+NK细胞为NK 细胞的主体，其数目及百分比的明显降低推测其可能在SLE 发生过程中发挥一定作用，这一结果与Lu 等［12］人研究结果类似。

SLE 临床表现存在高度异质性，在治疗时多根据受累器官及疾病活动度进行风险及效益评估，在达到控制效果的基础上降低药物不良反应，在这一过程中，疾病活动度的评估具有重要临床意义。目前临床多根据血常规、血沉、肝肾功能、免疫球蛋白、补体及抗体浓度判定活动度［13-14］，但发现更多新的生物学指标有利于临床进行更精确的个体化治疗。为探究CD3-CD16+CD56+NK 细胞对SLE 患者病情的关系及评估价值，本研究结果提示CD3-CD16+CD56+NK 细胞水平或可评估SLE 患者病情活动度，可用于辅助治疗及评估。这一结果与曹慧霞［15］、Lin 等人［16］的研究结果一致。目前CD3-CD16+CD56+NK 细胞与SLE 发生及发展的关系仍未明确，推测活动期SLE 患者体内存在大量抗体及免疫复合物，这些物质可能导致NK 细胞的减少及功能的降低，而SLE 患者NK 细胞的降低减轻机体对适应性免疫细胞的调节效应，导致适应性及固有免疫的失衡，造成机体免疫的进一步失衡［17］。如上文所示，CD3-CD16+CD56+NK 细胞水平与SLE活动度相关，其水平或可为早期评估SLE 病情提供一定参考。本研究结果提示其对SLE 患者活动度有一定评估价值，可作为辅助评估指标用于临床。

综上，SLE 患者存在CD3-CD16+CD56+NK 细胞水平的降低，且其水平与SLE 患者活动度密切相关，检测其水平或可为SLE 患者病情评估提供一定参考。本研究存在一定局限性，本研究区分患者活动度的标准为SLEDAI 评分，该评分标准本身存在一定局限，且目前较少有采用ROC 曲线分析CD3-CD16+CD56+NK 细胞评估SLE 病情的研究，这一结论仍尚需更多研究证实；另一方面，本研究样本量较少，未来仍有待进一步扩大样本进行验证。