含复合防腐剂食品微生物检验中稀释液的选择探讨

吴泽君 石文松 贺晶 罗雨阳 陈阳桔 胡群

摘 要：目的：探索微生物检验时，不同稀释液对同时含山梨酸和苯甲酸钠食品所具抑菌能力的影响。方法：制备不同pH且含山梨酸、苯甲酸質量浓度比分别为3∶1、3∶2、3∶4食品模拟样，分别以生理盐水和含表面活性剂并具pH缓冲能力的溶液为稀释液进行稀释，加菌作用30 min后检测菌落总数，分析比较不同稀释液对菌落生长的影响。结果：样品pH较低时含表面活性剂稀释液的菌落生长情况较好，pH较高时两种稀释液检验结果无明显差异，两种稀释液对不同防腐剂浓度比例的影响未见明显区别。结论：对较低pH复合防腐剂的样品，建议以含表面活性剂并具pH缓冲能力的溶液作为稀释液，减弱样品所具抑菌能力，以利于菌体生长或修复。

关键词：苯甲酸;山梨酸;微生物检验;稀释液;抑菌

Abstract：Objective： To explore the effect of different diluent on the antibacterial ability of the food containing both sorbic acid and sodium benzoate during microbiological testing. Methods： To prepare food simulants with different pH and mass concentration ratios of sorbic acid and benzoic acid of 3∶1， 3∶2， and 3∶4， respectively， which then were diluted with physiological saline and a solution containing surfactants and pH buffering capacity. To detect the aerobic plate count of the dilutions after adding bacteria for 30 minutes， and analyze and compare the effects of different dilutions on colony growth. Results： The number of the colonies of the dilutions containing surfactant of the lower pH samples were more than that of the dilutions of other samples. No significant difference was found between the the influence of the two diluents when the pH was high， or among the samples with different concentration ratio of preservatives. Conclusion： It is recommended to use a solution containing surfactants and pH buffering capacity as a diluent for microbiological test of the samples with lower pH containing compound preservatives， so as to weaken the antibacterial ability and to facilitate bacterial growth or repair.

Key words：Benzoic acid; Sorbic acid; Microorganism examination; Diluent; Antibacterial

中图分类号：TS207.4

防腐剂作为简便有效的产品保质措施被广泛应用多个行业中。受防腐剂抑菌作用影响，产品中多数微生物的生长繁殖被抑制，少部分被杀灭[1-2]，

还有部分成为非可培养状态（Viable but non-culturable，VBNC），处于VBNC的微生物仍可能存在一定危害，在一定条件下也可以诱导复苏[3-4]。因此，微生物检验中减弱防腐剂抑菌作用以及促进受损细胞修复的措施，可以更真实地体现样品的微生物污染状况。对复合添加山梨酸与苯甲酸的食品，在微生物检验中探索不同稀释液对其所具防腐剂抑菌能力的影响，有助于评估样品的微生物污染状况。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

某品牌果蔬饮料（未添加防腐剂）;卵黄卵磷脂、平板计数琼脂培养基（PCA），广东环凯微生物科技有限公司;磷酸氢二钠（AR）、磷酸二氢钾（AR）、盐酸（AR）、氢氧化钠（AR）、氯化钠（AR），国药集团;山梨酸钾（含量99.5%）、苯甲酸钠（含量99.5%）、吐温-80（含量99.5%），上海麦克林公司;金黄色葡萄球菌（CMCC（B）26003），中国食品药品检定研究院。

高压蒸汽灭菌锅，二级生物安全柜，恒温培养箱，电子天平，电子比浊仪，冰箱等。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

添加山梨酸钾、苯甲酸钠于该饮料中，使山梨酸钾、苯甲酸钠的浓度质量比分别为3∶1、3∶2、3∶4，浓度分别为0.15%和0.05%、0.15%和0.1%、0.15%和0.20%和。调节每个浓度模拟样的pH分别为3.5、4.5、5.5。

1.2.2 稀释液制备

0.85%氯化钠溶液（A），含3%吐温-80和0.3%卵磷脂的磷酸盐溶液（磷酸二氢钾3.56 g·L-1、磷酸氢二钠5.77 g·L-1）（B）。

1.2.3 菌悬液制备

将接种于平板计数琼脂斜面上金黄葡萄球菌24 h新鲜培养物（第3代），以灭菌生理盐水制备菌悬液，浓度约为2.5×104 CFU·mL-1。

1.2.4 检验与数据处理

两种稀释液各取250 mL，分别加入1 mL菌悬液，混匀，室温条件下作用30 min，各取1.0 mL检验菌落总数，平行试验5次，比较两者菌落生长的差别。

上述每种样品各取2份（200 mL/份），各取25 mL

用不同稀释液225 mL稀释，混匀，作用30 min。分别加入1 mL菌悬液于稀释后的样品液中，混匀，室温条件下作用30 min。每时间点稀释液均各取1.0 mL检验菌落总数。以等体积生理盐水替代检测样作为阳性对照，以各稀释液为空白对照，依法操作。平行试验5次，计算菌落数平均值。用IBM SPSS Statistics 20对菌落回收率进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 两种稀释液菌落回收比较

按α=0.05，两种稀释液加菌后的检测结果比较

（见表1），其总体方差相等（F=0.142，P=0.716），其菌落均数差别无统计学意义（t=-2.179，P=0.061）。

2.2 含复合防腐剂样品以不同稀释液处理后的菌落数检测结果

按α=0.05，pH3.5的样品，稀释液A处理更有利于菌落生长（FpH3.5=3 681.071，P=0.000）;pH4.5与pH5.5的样品，用稀释液A、B处理对菌落生长影响无区别（FpH4.5=3.170，P=0.059;FpH5.5=0.753，P=0.393）;各浓度比在相同pH时对菌落生长的影响无区别（FpH3.5=3.226，P=0.056;FpH4.5=2.641，P=0.116;FpH5.5=1.111，P=0.344）（见表2）。

3 讨论与结论

山梨酸和苯甲酸实际应用中常以盐的形式添加于大多数产品中，其主要通过钝化微生物相关酶的活性及破坏其功能[5]或干扰细胞的物质传递[6]，从而干扰微生物的生长代谢及使菌体受损。微生物检验对微生物生长存在干扰的情况常需通过恢复系统，解除微生物的生长抑制及促进受损菌体恢复[7]，给予微生物良好的生长繁殖环境，可反映实际的微生物污染状况。此情况在多类产品的微生物检验中得到重视，药品、化妆品等产品检验标准均规定了相应评估或消除、减弱防腐剂对微生物项目检验结果影响的措施或方法[8-9]，

食品或保健食品等产品检验标准见相关讨论或报道，认为应对此类情况予以重视[10-11]。

稀释液是微生物检验中促进微生物生长的恢复系统的组成因素之一。与0.85%氯化钠溶液比较，含3%吐温-80和0.3%卵磷脂的磷酸盐溶液对金黄色葡萄球菌生长无抑制，两种稀释液的菌落回收率无明显差异。将两者分别用于样品稀释处理及加金黄色葡萄球菌作用一定时间后研究发现，对pH3.5的样品，含3%吐温-80和0.3%卵磷脂的磷酸盐溶液比0.85%氯化钠溶液更有利于菌落生长。两者菌落数以及回收率悬殊较大，前者可以较好地消除山梨酸和苯甲酸联合抑菌能力，促进菌体生长。对于pH4.5与pH5.5的样品，两种稀释液的处理对菌落生长影响无明显区别。分析其原因，样品稀释后，其防腐剂浓度降低，pH也发生一定变化。山梨酸和苯甲酸均为酸性防腐剂，质子化形式存在是其产生抑菌能力的主要因素[7]，此随着样品pH值降低，其抑菌能力逐渐增加，越接近其pKa值，其质子形态存在的物质越多，抑菌能力越明显;在低pH值时较小的浓度也具很好的抑菌能力[1]。有研究报道，质量浓度为0.02%的山梨酸与苯甲酸复合防腐剂对大肠杆菌和金黄色葡萄菌的生长有较明显的抑制作用[12]。在含3%吐温-80和0.3%卵磷脂的磷酸盐溶液的稀释液中，吐温-80、卵磷脂均为表面活性剂。吐温-80具有很好的分散能力，可消除菌体吸附的防腐剂以及在其表面形成保护膜，卵磷脂为两亲分子结构，有界面吸附能力，同样可在菌体表面形成保护膜，避免或减少细胞损害[13];此外，吐温-80可以介导受损菌体的复苏[14]。以磷酸盐所组成的缓冲体系对pH有较好的缓冲能力，样品处理后其pH变动较大，质子化状态存在的物质较少，使防腐剂发挥抑菌的作用较小。0.85%氯化钠溶液对防腐剂抑菌能力的干扰，可能主要为防腐剂浓度的稀释和样品pH的变化，但其pH缓冲能力相对较弱，样品处理后pH变动较小。因此pH3.5时，前者对防腐剂的抑菌能力发挥综合干扰作用，使两者的菌落生长情况相差较大;而pH4.5和pH5.5时，样品经两者处理后，其pH变化可能均足以影响防腐剂发挥的抑菌能力，从而未体现明显差别。相同pH时，同一稀释液处理不同浓度比防腐剂组合的样品，菌落生长的情况无明显区别。对0.85%氯化钠溶液来说，pH可能是主要的影响因素;而低pH时，复合稀释液对不同浓度组合的防腐剂的抑菌能力均有很好的干扰作用。

含3%吐温-80和0.3%卵磷脂的磷酸盐溶液对联用的山梨酸和苯甲酸具较好的消除或降低其抑菌能力的作用，尤其低pH时比0.85%氯化钠溶液更更利于微生物的修复和生长，在样品pH不明确时，使用前者可以更好地避免上述防腐剂对微生物检验结果的干扰。

参考文獻：

[1]]刘天意.食品防腐剂苯甲酸钠的作用机理、毒性及其检测方法综述[J].现代食品，2020（7）：

32-34.

[2]王征征，李玉峰，李明元，等.防腐剂对腌制大头菜中腐败微生物的抑制效果研究[J].中国食品添加剂，2016（1）：119-126.

[3]Dong K，Pan H X，Yang D，et al.Induction， detection， formation， and resuscitation of viable but non‐culturable state microorganisms[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2020，19（1）：149-183.

[4]Zhao X H，Zhong J L，Wei C J，et al.Current Perspectives on Viable but Non-culturable State in Foodborne Pathogens[J].Frontiers in Microbiology，2017，8：580.

[5]遲玉杰.食品添加剂[M].北京：中国轻工业出版社，2013.

[6]杰伊.现代食品微生物学[M].北京：中国轻工业出版社，2001.

[7]王艳萍，赵虎山.化妆品微生物学[M].北京：中国轻工业出版社，2002.

[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015.（下转第页）

（上接第页）

[9]国家药品监督管理局.国家食品药品监督管理总局关于发布化妆品安全技术规范（2015年版）的公告（2015年第268号）[EB/OL].（2015-12-23）[2020-07-11].https：//www.nmpa.gov.cn/hzhp/hzhpggtg/hzhpqtgg/20151223120001986.html.

[10]杨晓莉，李翠，李辉.不同功能保健食品致病菌检测方法问题探讨[J].药物生物技术，2015，22（3）：248-252.

[11]岳丽晓.食品防腐剂影响微生物指标检验结果的机制[J].生物化工，2017，3（1）：36-37，50.

[12]胡春红，陈龙，李季平，等.苯甲酸钠和山梨酸钾的复配抑菌效果研究[J].中国调味品，2012，37

（3）：46-49.

[13]张流波，杨华明.医学消毒学最新进展[M].北京：人民军医出版社，2015.

[14]Trinh N T T，Dumas E，Thanh M L，et al.E?ect of a Vietnamese Cinnamomum cassia essential oil and its major component trans-cinnamaldehyde on the cell viability， membrane integrity， membrane fluidity， and proton motive force of Listeria innocua[J].Canadian Journal of Microbiology，2015，61（4）：263-271.