运用网络药理学与分子对接法探讨阳和汤治疗股骨头坏死的核心作用机制

孙世辉,许恒,张金民,王波清,刘振华

(1.河北大学中医学院中医基础教研室，河北 保定 071000；2.河北大学中医学院2016级中医二班，河北 保定 071000；3.中国人民解放军陆军第八十二集团军医院中医科，河北 保定 071000)

股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH )是骨科常见病、难治病,高发于20～40岁中青年人[1],据报道[2]，中国的患病人数已超过500万且病例基数每年以15万～20万例的比例增长。ONFH自然进展快，若不及时干预治疗,多数患者可在1～4年内发展为股骨头塌陷、髋关节继发性骨性关节炎,严重者需要接受髋关节置换术[3-5]。股骨头坏死危险因素很多，包括糖皮质激素的频繁使用、酗酒、股骨颈骨折、股骨头骨骺滑脱、髋关节脱位、镰状细胞贫血、系统性红斑狼疮等因素。但其具体发病机制至今仍不明确,对此,国内外学者提出了各种学说:血运障碍、脂质代谢紊乱、骨内压增高、骨细胞凋亡、基因多态性、免疫因素等[6-8]。ONFH属于中医学“骨痹”“骨蚀”的范畴。阳和汤(Yanghe Tang,YHT)方出自清代著名中医外科医家王洪绪的著作《外科证治全生集》，该汤剂由熟地、肉桂、白芥子、姜炭、生甘草、麻黄、鹿角胶等中药组成。近年来被广泛用于膝骨关节炎、强直性脊柱炎、腰椎间盘突出症、骨质疏松症等多种骨伤科常见疾病的治疗[9]。有研究[10]表明，阳和汤能抑制骨关节炎炎症反应，修复软骨损伤，可能与降低炎症因子TNF-α和IL-1β的表达，抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。据现有临床研究结果[11-12]，运用阳和汤加减方对早期的股骨头坏死具有良好的临床疗效，且54例临床对照实验显示结果差异显著。然而目前，YHT治疗ONFH的药理分子机制尚未清楚，运用网络药理学与分子对接法，在临床验证的基础上初步探究YHT干预ONFH的核心化合物、靶点与关键通路，为进一步的实验研究作铺垫。

1 资料与方法

1.1 YHT化合物信息的收集和中药-化合物-靶点网络的构建

本研究以YHT方中药物组合(熟地、肉桂、白芥子、姜炭、生甘草、麻黄、鹿角胶)为检索词，运用中药系统药理学数据库TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)对中药相关活性成分进行检索，并按照口服吸收利用度(OB)≥30%，药物相似性(DL)≥0.18的推荐筛选指标，进一步筛选高活性化合物。

利用TCMSP数据库，查询YHT中主要成分的作用靶点，并利用Uniprot数据库(https://www.genecards.org/)对靶点名称进行基因名的转换与校正，使靶点名称标准化，并将YHT的化合物与靶点的关系信息导入Cytoscape 3.7.1软件，构建中药-化合物-靶点网络。

1.2 YHT治疗ONFH的潜在作用靶点的获取

基于GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，选择物种为“Homo sapiens”，以“osteonecrosis of the femoral head”为关键词进行检索，得到ONFH的相关靶点基因。运用Venny 2.1在线绘图工具，对化合物预测靶点与疾病预测靶点进行交集映射，获取阳和汤治疗ONFH的潜在靶点，研究流程如图1所示。

图1 网络药理学与分子对接法的研究流程

1.3 YHT治疗ONFH的核心化合物的筛选

为了进一步筛选YHT治疗ONFH的核心化合物，将YHT治疗ONFH的核心作用靶点映射到相应的化学成分上，并在Cytoscape 3.7.1构建了YHT化合物与核心作用靶点的网络，通过网络拓扑分析，筛选出核心化合物。

1.4 PPI蛋白质互作网络的建立与核心靶点的筛选

为进一步了解核心靶点之间的相互作用关系，将1.3筛选出的共同靶点，导入STRING数据库，选择物种为“Homo sapiens”，置信度设置大于0.700，获取PPI蛋白互作网络信息。然后导出PPI网络的蛋白质互作信息TSV文件，然后将TSV文件数据导入Cytoscape 3.7.1中，运用插件分析网络拓扑参数，以节点度值、介值中心度均超过平均值为标准，筛选出阳和汤治疗ONFH的核心靶点。

1.5 DAVID数据库的功能注释与通路富集

为了进一步明确核心靶点基因的生物学功能和阳和汤方治疗ONFH的主要通路，将以上得到的药物与疾病共同靶点基因导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，选择靶基因列表与物种为“homo sapiens”，校正靶基因名称为“offcial gene symbol”，设定阈值P<0.01,进行基因本体功能GO富集，具体包括生物过程BP、细胞成分CC、分子功能MF的富集分析；同时进行KEGG通路富集分析，最后运用RStudio 3.6.3软件对GO与KEGG富集结果进行可视化处理，并绘制“化合物—靶点—通路网络图”。然后通过Cytoscape软件的GlueGO插件获取KEGG富集通路网络图。

1.6 核心化合物与关键靶点蛋白的分子对接分析

从RSCB数据库(http://www.rcsb.org/)中获取ONFH关键靶点蛋白Hypoxia-inducible factor 1-alpha(HIF-1a)和vascular endothelial growth factor A(VEGFA)的蛋白晶体结构，使用Autodock Tools软件对晶体结构进行水分子删除和加氢处理，并计算电荷，保存为pdbqt格式文件。从ZINC数据库下载核心化合物的3D结构的Mol2格式文件，使用Autodock Tools软件对小分子进行平衡电荷处理，利用Pymol处理蛋白小分子结构，并设置GirdBox，确定对接口袋，最后选择Genetic Algorithm Parameters算法进行分子对接。

2 结果与分析

2.1 阳和汤主要活性成分的筛选与化合物-靶点网络的构建

通过TCMSP数据库检阳和汤化合物，依据OB≥30%，DL≥0.18，筛选出119个主要化合物。将得到的119个化合物通过TCMSP数据库预测对应的靶点，去除重复值，共得到226个作用靶点，借助Cytoscape 3.7.1软件构建中药-化合物-靶点网络(图2)，其中网络共有995条边和301个节点。根据网络拓扑学分析，在所有活性成分中，degree值排前六位的节点的化合物包括槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、油酸(oleic acid)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-谷甾醇 (beta-sitosterol)、甘草查尔酮A (Licochalcone A)，这些化合物在此网络中具有更高自由度和更活跃的作用关系。

倒三角形节点为化合物，实心圆形节点为靶点图2 YHT化合物-靶点网络

2.2 YHT治疗ONFH的潜在作用靶点预测

图3 YHT和ONFH靶点映射

根据GeneCards数据库检索ONFH的相关治疗靶点，共得到284个靶点。借助Venny在线软件，将YHT中主要活性成分的作用靶点与ONFH的靶点相互映射，得到40个交集靶点，具体内容见表1。并绘制韦恩图(图3)，40个共同靶点即是阳和汤治疗ONFH的潜在作用靶点。

表1 药物与疾病的40个潜在靶点信息

2.3 YHT治疗ONFH的核心化合物的筛选

将YHT治疗ONFH的40个潜在靶点，映射到相应的化学成分上,并运用Cytoscape3.7.1软件，建立了YHT—化合物—潜在靶点—疾病网络图，如图4所示，为了进一步筛选关键化合物和目标，对图3网络进行拓扑分析，得到节点值(degree)、中心介度值(between centrality，BC)和紧密中心性(closeness centrality，CC)3个网络拓扑参数，筛选标准所依据的参数是高于3个参数均值的2倍[13]，筛选出8个核心化合物，见表2。

图4 YHT—化合物—潜在靶点—疾病网络

表2 关键化合物的相关信息

2.4 潜在靶点蛋白的相互作用网络(PPI)的构建与核心靶点的筛选

将化合物与疾病映射得到的40个交集靶点信息，导入STRING数据库，设置置信度大于0.700，导出TSV格式文件并导入Cytoscape进行网络拓扑分析与可视化处理(图5)，该网络由40个节点、117条边组成。利用Cytoscape进行网络拓扑分析：平均degree为21.8，大于平均degree的节点有20个。根据网络节点的degree筛选出前20个靶点(靶点信息见表3)，其中选取degree值排在前五的靶点作为核心靶点，包括IL6、TNF、TP53、VEGFA、CASP3，与ONFH直接相关的重要靶点包括VEGFA、CASP3、HIF-1α、IL6、TNF等。

表3 PPI蛋白互作网络中degree值排前20的作用靶点信息

颜色越深代表其蛋白的相互作用越强，IL6、TNF、VEGFA、TP53、CASP3为PPI网络的核心作用靶点。图5 YHT治疗ONFH潜在靶点的蛋白质相互作用

2.5 潜在靶点的GO生物功能注释与KEGG通路富集分析

基因本体GO是生物信息学领域广泛使用的本体，包含生物学过程(biological process，BP)，分子功能(molecular function，MF)和细胞组分(cellular component，CC)。利用DAVID数据库对40个潜在作用靶点进行GO富集分析，选择物种为“Home sapiens”，据P≤0.01的标准保留结果，并借助Rstudio软件对BP、MF和CC的Pvalue值排10的条目进行可视化分析(图6)，其中纵坐标表示参与富集分析的靶点信息，横坐标表示富集个数。与ONFH直接相关的生物学过程BP terms涉及“凋亡过程的负调控(negative regulation of apoptotic process)，血管生成的正调控(positive regulation of angiogenesis)” 。细胞组分CC terms主要涉及细胞外空间(extracellular space)和细胞外区域(extracellular region)等，与ONFH间接相关的分子功能MF包括“细胞因子活性(cytokine activity)和酶结合(enzyme binding)等”。

通过DAVID数据库对40个潜在靶点进行KEGG富集分析，根据P<0.01保留结果，通过Rstudio软件数据的可视化处理，获取Pvalue排前20的KEGG通路气泡图(图7)，其中HIF-1信号通路是重要低氧反应信号，使软骨细胞的代谢转向节氧途径并激活软骨无氧酵解,以适应缺氧环境[14]，TNF 信号通路与股骨头坏死局部坏死性炎症相关[15]，PI3K-Akt 信号通路参与ONFH的成骨细胞增殖和分化[16]，P53信号通路与骨髓间充质干细胞中的细胞吞噬作用相关[17]。

BP生物学过程;MF分子功能;CC细胞组分。图6 潜在靶点GO富集

通过Cytoscape 3.7.2软件的GlueGO插件，获取KEGG富集通路网络图(图8)。KEGG富集通路网络图中展示的每一个节点是具有代表性的富集通路，节点的连线反映了通路之间的共有基因数，代表了通路之间的相关性，节点的颜色则反映了该节点的富集分类情况，经过GlueGO汇总分析，获得了7个KEGG富集分类组，其中与股骨头坏死相关的聚类分组有：糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)，IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)，流体剪切应力和动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)。这三组聚类均可直接或间接引起股骨头坏死性炎症或股动脉血流循环障碍，进而引发股骨头坏死。

圆点的面积越大，代表通路上富集的基因数目越多图7 潜在靶点的KEGG通路富集

图8 KEGG富集通路网络聚类

2.6 构建YHT治疗ONFH的成分—靶点—通路网络图

将潜在靶点、潜在靶点关联的61个化合物与关联的62个KEGG信号通路的关系信息，导入Cytoscape3.7.1软件，构建阳和汤治疗ONFH的成分—靶点—通路网络图(图9)，综合体现了阳和汤“多成分—多靶点—多通路”对ONFH的治疗干预作用，表4展示了与ONFH治疗的相关重要通路与靶点信息，包括HIF-1信号通路、TNF 信号通路、PI3K-Akt信号通路、P53 信号通路[14-17]。

表4 ONFH相关重要通路与靶点信息

箭头节点代表靶点；方块节点代表KEGG通路；圆节点代表化合物成分。图9 成分—靶点—通路网络

2.7 分子对接结果

为了验证网络分析得到的关键化合物与关键靶点之间发生相互作用的正确性，故运用计算机模拟药物结合的分子对接法，对两者进行几何匹配和能量匹配的预测，并筛选出最佳的分子结合方式。HIF-1a与VEGFA是治疗ONFH的关键蛋白[19-22]，将表2中的8个核心化合物(未从NCBI数据库找到3’-Hydroxy-4’-O-Methylglabridin MOL2格式的化学结构信息)和其他4个重要化合物，与以上两个关键蛋白进行分子对接，结合能小于0代表化合物与蛋白可以自发结合，结合能越低，发生作用的可能性越大。以结合能≤-5 kcal/mol作为筛选标准，分别选择结合能最小的分子对接模式进行展示。22种对接方式的结合能见表5，结果可见槲皮素与HIF-1α对接的结合能最低，豆甾醇与VEGFA对接的结合能最低，图10显示了这两种对接方式的计算机模拟图。

表5 主要化合物与HIF-1α和VEGFA蛋白的结合力

结合能小于0代表化合物与蛋白可以自发结合，结合能越低，发生作用的可能性越大。

A 槲皮素与HIF-1α的对接模式图，结合键的类型为H键;B 槲皮素结构式;C 豆甾醇与VEGFA的对接模式图，结合键的类型为H键； D 豆甾醇结构式。图10 两种对接方式计算机模拟

3 讨论与分析

本研究通过TCMSP数据库，检索到阳和汤方中主要活性化合物119个，经过Uniprot基因校正后，得到226个靶点基因。进一步地，从方剂—化合物—潜在靶点—疾病网络获取了八个核心化合物分子，分别是槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇、Gancaonin B、甘草查尔酮A、shinpterocarpin、3’-Hydroxy-4’-O-Methylglabridin。从GeneCards数据库中获得ONFH的284个疾病靶点，通过交集映射获得阳和汤治疗ONFH的潜在作用靶点40个。通过对40个潜在靶点的PPI蛋白互作网络分析，筛选出与ONFH直接相关的重要靶点：VEGFA、CASP3、HIF-1α、IL-6、TNF。分子对接结果可见 quercetin与HIF-1α、Stigmasterol与VEGFA的两种分子结合方式是最容易发生的。最后通过对40个核心靶点的GO功能注释和KEGG富集分析，预测阳和汤可能通过HIF-1信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路等途径，调控ONFH进程中的免疫炎症反应、骨代谢和血液循环供应，从而达到干预治疗ONFH的作用。

阳和汤治疗股骨头坏死的潜在靶点中，活化胱天蛋白酶(caspase)3在成骨细胞凋亡过程中起着关键作用,与骨形成密切相关。caspase 等多种与骨细胞凋亡相关的基因,导致ONFH[18]。HIF-1α对软骨细胞的生长起着重要作用，HIF-1α可能激活部分下游基因,使软骨细胞的代谢转向节氧途径并激活软骨无氧酵解,以适应缺氧环境[19]。VEGF水平上调后与其受体结合,启动VEGF下游通路,进而调控ONFH区血管新生。主要体现于两方面：VEGF调控破骨细胞能促进内皮细胞成血管作用，VEGF还介导内皮细胞迁移,对于坏死区域血管新生至关重要[20-22]。

阳和汤治疗股骨头坏死的机制，主要是通过影响骨质代谢、血液循环、炎症与免疫调节等三方面来发挥药理作用，基于KEGG通路富集和GO功能注释发现，阳和汤方治疗ONFH的通路富集结果显示，其核心靶点基因参与的通路主要涉及：调节骨代谢的PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)；调节机体“免疫-炎症系统”平衡的TNF信号通路(TNF signaling pathway)；与血液循环供应相关的信号通路包括HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)，血管内皮生长因子信号通路(VEGF signaling pathway)，血管生成的正向调节(positive regulation of angiogenesis)。

血管生成在ONFH疾病修复过程中起着重要作用[23]，HIF-1α已被证明是最主要的组织缺氧的调节因子[24]。HIF-1信号通路与VEGF信号通路在ONFH中呈现互相调节作用，骨组织的缺血缺氧使得HIF-1α激活和表达，HIF-1α激活的靶点包括：VEGF、一氧化氮合成酶(NOS)、促红细胞生成素(Epo)。VEGF可表达在生长板软骨细胞中，可调控原始松质骨中血管的生成；Epo是强有力的造血生长因子,除外诱导形成成熟的红细胞集落，还可激活成骨细胞和骨髓间充质细胞增殖[25]，并直接促进小鼠骨折模型的骨痂形成及软组织修复[26]；HIF-1α还可激活NOS的转录，从而促进血管生成和血管舒张[27]。股骨头局部缺血损伤后，骺软骨是HIF-1途径激活的作用位点，并参与了血液重建[28]。此外，研究[29]发现HIF-1α转染的细胞能在兔股骨头内，促进血管新生和BMCs的成骨分化能力。因此预测阳和汤可通过HIF-1信号通路，促进股骨头供血动脉的舒张和吻合支的生成，来干预股骨头坏死的进程。

PI3K-Akt信号通路是骨质恢复再生的重要信号通路，通过调节成骨细胞与破骨细胞的增殖分化而促进骨重塑的过程。PI3K-Akt信号通路在增加成骨细胞增殖活性的同时,也可通过糖原合成激酶3β实现对Wnt/β-catenin的调控，从而加强成骨细胞的分化增殖[30]。有研究发现减弱PI3K-Akt信号通路能抑制成骨细胞的增殖,但能增加成骨细胞的分化[31]。 此外，PI3K-Akt信号通路可通过促进成骨细胞释放两种关键的因子M-CSF和RANKL，来触发破骨细胞分化，当RANKL结合受体后,下游信号(NF-κB、JNK、p38 MAPK)会被激活诱导破骨细胞的分化。而c-fos、活化T细胞核因子1等可通过调控下游激酶(NF-κB、p38 MAPK)的表达对破骨细胞的分化造成影响，下游激酶(NF-κB、p38 MAPK)通过被c-fos、活化T细胞核因子1的调控，而表达对破骨细胞的分化的影响[32-33]。故预测阳和汤或可通过调控PI3K-Akt信号通路，调控髋关节骨质代谢，促进坏死骨质的代谢和新骨的再生。