样本溶血对血凝抑制试验和胶体金法检测新城疫病毒抗体的影响

杭柏林,刘保国,吴世秀,邓丽,陈文杰

（1.河南科技学院动物科技学院,河南新乡453003；2.扬州大学兽医学院教育部禽类预防医学重点实验室,江苏省动物预防医学重点实验室,江苏扬州225009）

新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起多种禽类如鸡、鸭、鹅、鸽、雉、鹦鹉、鹌鹑等的新城疫（Newcastle disease,ND）,是一种急性败血型高度致死性传染病,发病率和病死率可达100%[1-2].新城疫对世界各国养禽业的危害巨大,是一种烈性传染病,被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物疫病[1].疫苗免疫接种是预防新城疫的有效方法.免疫后常常需要定期进行免疫效果的监测与分析.新城疫病毒免疫效果监测有许多不同的方法,其中血凝抑制（HI）试验操作简单,在基层得到了广泛应用.影响血凝抑制试验的因素有很多,如器材、试剂、反应温度、反应时间、红细胞、血清等[2-3],其中血清样本是一个重要的影响因素.血液样本在制备成血清的过程中常常会出现溶血.样本溶血对某些测试或检测结果产生影响.高晓波等[4]报道,样本溶血对HI 试验检测禽流感病毒抗体有一定的影响.另外,胶体金法是一种检测抗原和抗体的比较灵敏的方法,因简单、快速的特点而得到广泛应用.因此,本研究通过制备不同程度溶血样本,观察其对HI 法和胶体金法检测新城疫病毒抗体的影响,希望为生产实践提供一些建议和帮助.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

氯化钠购自天津市天力化学试剂有限公司,柠檬酸钠购自天津市博迪化工有限公司,新城疫活疫苗（La Sota 株）购自哈药集团生物疫苗有限公司,新城疫病毒血凝抑制试验标准阳性血清购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司,新城疫病毒抗体胶体金检测卡购自北京中科越洋科技有限公司.

T2020B 电子天平,常熟市天量仪器有限责任公司；MJ-78A 高压蒸汽灭菌器,上海施都凯仪器设备有限公司；TG16-WS 离心机,BCD-325WKY1DPM冰箱,广东海信容声冰箱有限公司；HH-B11 培养箱上海医疗器械七厂.

1.2 试验方法

1.2.1 1%红细胞悬液的制备 从新乡市洪门镇中心菜市场采集健康公鸡（2.5 kg 左右）的血液,用3.8%柠檬酸钠抗凝,然后按照文献[5]的方法制备1%鸡红细胞悬液.

1.2.2 模拟不同程度溶血样本 取3.8%柠檬酸钠抗凝的新鲜鸡血液1 mL,按照红细胞悬液制备方法进行红细胞洗涤,洗涤后加灭菌生理盐水至1 mL,冻融2 次,4 000 r/min 离心10 min,上层为无抗体的完全溶血液（A 液）.按照表1 中设定的量,加入灭菌生理盐水和新城疫病毒标准阳性血清,混合后制备出不同溶血程度的样本.

表1 模拟不同程度溶血样本中所加试剂的量Tab.1 Amount of reagent added to different degrees of simulated hemolysis samples μL

1.2.3 临床样本的制备 从翅静脉采集新城疫疫苗免疫鸽的血液,同一血液样本分成两份.一份血液于4 000 r/min 离心10 min,上清即为常规方法制备的血清.另一份血液置于-20 ℃约4 h,取出后,室温下融化,而后再冻融1 次,然后于4 000 r/min 离心10 min,上清即为冻融方法制备的溶血血清.

1.2.4 血凝抑制试验 按文献[6]的方法进行新城疫病毒的血凝抑制试验.

1.2.5 胶体金法 按照新城疫病毒抗体胶体金检测卡说明书进行操作.

1.2.6 统计分析 利用GraphPad Prism 软件中的统计分析工具Paired t test（one-tailed,Confidence Intervals为95%）对检测结果进行统计分析.

2 结果与分析

2.1 检测样本的制备结果

用于HI 检测和胶体金法检测的样本如图1 所示.在不溶血的新城疫病毒抗体阳性血清溶液中加入不同量的人工制备的溶血液,随着加入溶血液量的增加,样本的颜色越来越深,结果如图1-A 所示.通过常规方法制备的60 份血清样本中,根据溶血程度区分,主要有4 种类型：不溶血样本（图1-Ba,清亮的黄色）有48 份,占比80%；微量溶血样本（图1-B-b）,相当于模拟溶血样本中溶血程度≤5%的样本）有6份,占比10%；轻微量溶血样本（图1-B-c）,相当于模拟溶血样本中溶血程度在5%～10%的样本）有4 份,占比6.67%；轻量溶血样本（图1-B-d）,相当于模拟溶血样本中溶血程度10%～15%的样本）有2 份,占比3.33%.冻融制备的样本颜色非常深,图1-C 中,c 样本颜色最深,a 样本次之,b 样本比a 和c 样本稍淡,但所有冻融样本颜色均比图1-A 中50%溶血样本深很多,表明冻融样本的溶血程度远远高于50%.

图1 检测样本的制备结果Fig.1 Preparation results of test samples

2.2 HI 试验检测结果

对模拟不同程度溶血样本进行新城疫病毒抗体血凝抑制（HI）试验检测,结果如表2 所示.5%～45%溶血样本的检测结果与不溶血样本（0%）检测结果一致,但50%溶血样本检测结果降低了1 个HI 效价.

表2 模拟不同程度溶血样本新城疫病毒抗体检测结果Tab.2 Test results of NDV antibody in different degrees of simulated hemolysis samples

对60 份临床鸽子样本进行新城疫病毒抗体血凝抑制（HI）试验检测,结果如表3 所示.按常规方法制备的血清样本中有4 份检测结果≥11log2,在这4 份冻融样本中,有3 份检测结果一致,有1 份检测结果降低.以常规方法制备的血清样本检测结果为标准,将冻融样本检测结果与之比较,检测结果一致的样本有23 份,占比38.33%,检测结果上升的样本有13 份,占比21.67%,检测结果下降的样本有24 份,占比40%.将常规方法和冻融法制备样本检测结果进行t 检验统计分析,如图2 所示,结果冻融样本的总体平均值显著低于常规血清（P＝0.032,P＜0.05）.

表3 临床样本的HI 试验检测结果Tab.3 Results of clinical samples with HI test log2

图2 常规方法和冻融方法制备样本HI 平均效价Fig.2 The average HI titer of samples prepared by conventional method and freeze method

2.3 样本溶血对HI 检测结果判定的影响

样本溶血对检测结果判定时的影响如图3 所示.在对不溶血的黄色血清、常规制备时部分溶血样本（非冻融的溶血样本）和冻融溶血样本的检测结果进行判定时,仅极个别样本第1 孔的结果不太清晰,而后续孔结果都能较好呈现,除了冻融样本的第2 孔结果可能稍微模糊,但仔细观察仍能判定.

图3 溶血样本对HI 检测结果判定的影响Fig.3 Effect of sample hemolysis on the determination of HI test results

2.4 胶体金法检测结果

通过胶体金法对制备的不同溶血样本进行新城疫病毒抗体检测,结果如图4 所示.所检测的样本均在检测卡上出现一条红色的线,表明检测样本中存在新城疫病毒的抗体,且抗体效价≥5log2.模拟不同溶血程度样本和不溶血鸽血清样本检测结果条带非常清晰,判定时非常容易；虽然冻融样本检测结果条带周围颜色稍深,但仔细观察仍能看到正确结果.

图4 胶体金法检测结果Fig.4 Detection results of colloidal gold method

3 讨论

溶血是临床样本检测时常常遇到的问题,对临床样本检测常常产生干扰[7-8].血液样本在采集、运送、分离和保存过程中因为剧烈碰撞、温度变化、渗透压降低等理化因素的影响可能会导致细胞破裂,细胞内容物进入细胞外液,从而稀释了细胞外液,细胞外液中抗体的量也即得到了稀释[4,9-10].因此,在理论上,检测结果会下降.在本研究中,模拟溶血样本中高度溶血样本检测结果下降,临床冻融溶血样本抗体检测结果下降的样本量占比最高,在总体水平上也是下降的,基本上与理论预测结果相符合.在临床冻融溶血样本中,少部分样本检测结果上升了,这与高晓波等[4]的结果相一致.如何解释这两者之间的差异确实是个难题,还需要进一步深入研究.

样本溶血几乎不影响HI 试验和胶体金法检测新城疫病毒抗体结果的判定.溶血后,样本颜色会有不同程度的加深.样本颜色的加深可能会对HI 试验的第1～2 孔的判定稍有影响,但随着稀释度的增加,对后续孔的判定没有任何影响.样本颜色的加深对胶体金法结果的判定可能会有影响,高度溶血样本的颜色非常深,会影响结果的判读,可通过加大缓冲液的量使呈色物质进一步稀释或展开,最终可得到准确的结果.

4 结论

样本溶血几乎不影响HI 试验和胶体金法检测新城疫病毒抗体结果的判定,但高度溶血会影响HI试验检测新城疫病毒抗体的检测结果,样本制备时应尽可能避免溶血.