电子线照射对小鼠胰岛素生长因子相关蛋白表达的影响

袁 慧，刘梦雅，许文黎，胡 波，张亚娟，尹晶晶，岳 娟，李建国

(中国辐射防护研究院药物安全性评价中心，山西 太原 030006)

胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)是一类结构与胰岛素相似的多肽，主要包括IGF-1 和IGF-2 两类多肽类生长因子，以及其相应受体IGF-1R、IGF-2R 和至少6 种胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP)。IGF 在各脏器中起着重要的代谢作用，控制各种细胞的增生、分化和凋亡进程。由于IGF 在人体生命活动中承担着重要作用，所以电离辐射后它的表达变化显得尤为重要[1-5]。前期本课题组已经得出辐射后IGF基因表达的变化情况[6-8]，本文将从蛋白水平上研究照射后小鼠体内胰岛素生长因子表达的变化。

本实验采用Western blot 方法检测电子线照射小鼠后，小鼠肝脏中IGF1、IGF-1R、IGFBP1和IGFBP4蛋白的表达情况，为之后探讨电离辐射对IGF 的影响及其机制提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级BALB/c 雄性小鼠100 只，25～30 g，由中国食品药品检定研究院生产，实验动物生产许可证号SCXK(京)2014-013；中国辐射防护研究院GLP中心动物实验室饲养管理，实验动物使用许可证号SYXK(晋)2013-0002。

1.2 辐照源

电子线采用直线加速器6 MeV 照射，Elekta Synergy，英国Elekta Limited 公司生产，山西白求恩医院放疗科提供，源皮距为100 cm，剂量率为3 Gy/min。

1.3 仪器

台式离心机，德国Heraeus instrumennts 公司生产；电动匀浆机，CONNTROL公司生产；高速冷冻离心机，ThermoFisher Scientific 公司生产；电泳仪PowerPacTMBasic，BIO-RAD 公司生产；转膜仪Tras-Blot， BIO-RAD 公 司 生 产； 程 控 金 属 浴Inanbator Thermoelectric公司生产。

1.4 试剂

哺乳动物组织总蛋白提取试剂、小鼠anti-β-actin一抗、BCA蛋白质定量试剂盒、超敏ECL化学发光底物、过硫酸铵Ammonium Persulfate，均购自博士德生物工程有限公司；广谱彩虹预染蛋白Marker购自康为世纪生物科技有限公司。

1.5 动物分组及照射

100 只雄性BALB/c 小鼠，随机分为3 个不同剂量的电子线照射组(每组30 只)和1 个空白对照组(10 只)。照射组采用直线加速器全身照射小鼠，每次照射30只，照射剂量依据之前基因芯片筛选时的有效剂量设定，分别为1、2、4 Gy，剂量率为3 Gy/min。

1.6 Western blot检测

1.6.1 总蛋白提取和浓度测定分别于照射后12、48、72 h将小鼠麻醉后摘取肝脏，置于预冷的生理盐水中漂洗数次后，称取100 mg，加入蛋白裂解液(含1 μL PMSF)，用超声破碎仪进行组织匀浆。匀浆后静置3 h，后离心取上清置于-20 ℃保存。按照BCA 法制备蛋白样品，用酶标仪测定样品的蛋白浓度。

1.6.2 进行SDS-PAGE电泳按比例配制12%的分离胶和8%的浓缩胶，加入浓度为5 μg/μL的蛋白样品和标准品，采用恒压的模式，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处停止。

1.6.3 转膜SDS-PAGE 结束后，按照标准的“三明治”方法将条带转移至PVDF 膜上，转膜结束后，用TBST洗3次，采用浓度为5%的BSA封闭1 h，漂洗后放入一抗稀释液孵育过夜。然后漂洗3 次，放入HRP标志的二抗稀释液中，室温孵育2 h。

1.6.4 显影将配制好的超敏ECL 化学发光液与膜蛋白面充分接触，将胶片进行扫描拍照，用凝胶图像处理系统分析目标条带的相对分子质量和光密度值。

1.7 统计学分析

采用SPSS 17.0 进行数据分析，积分光密度比值以均数±标准差表示，组间差异采用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 1 Gy 电子线照射后小鼠肝脏组织胰岛素生长因子相关蛋白的表达情况

Western blot 检测1 Gy 电子线照射后3 个时间点小鼠肝脏中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白的相对表达水平，结果采用检测蛋白与内参蛋白β-actin积分光密度的比值表示，见图1 和表1。与对照组比较，照射后3 个时间点，IGF-1 蛋白的积分光密度比值除了照射后48 h 时＞1，其余均＜1(均为P＜0.05)；IGFBP1、IGFBP4 和IGF1R 蛋白的表达情况相同，积分光密度比值均＜1(均为P＜0.05)。由此可以看出，1 Gy电子线照射后，小鼠肝脏组织中IGF-1蛋白在照射后48 h 时表达增加，IGFBP1、IGFBP4 和IGF1R 蛋白在照射后12、48和72 h时表达均减少。

2.2 2 Gy 电子线照射后小鼠肝脏组织胰岛素生长因子相关蛋白表达情况

2 Gy 电子线照射后，Western blot 法检测小鼠肝脏中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白的相对表达水平，结果见图2和表2。与对照组比较，照射后3个时间点，IGF-1 蛋白和IGFBP4 蛋白的表达情况相同，与β-actin积分光密度的比值除了照射后48 h时＞1，其余均＜1(均为P＜0.05)；IGFBP1蛋白的积分光密度比值，在照射后12 h 时＞1，48、72 h 时＜1(P＜0.05)；IGF1R蛋白的积分光密度比值在各个时间点均＜1(均为P＜0.05)。由此可以看出，2 Gy电子线照射后，小鼠肝脏中IGF-1和IGFBP4蛋白在照射后48 h时表达增加，其余时间点为表达减少。IGFBP1蛋白在照射后12 h时表达增加，48和72 h时为表达减少。IGF1R蛋白在照射后3个时间点均呈现为表达减少。

图1 Western blot检测1 Gy电子线照射后不同时间小鼠肝脏中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白表达情况

表1 1 Gy 电子线照射后不同时间小鼠肝脏中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白相对表达水平比较

图2 Western blot 检测2 Gy 电子线照射后不同时间小鼠肝脏中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白表达情况

表2 2 Gy 电子线照射后不同时间小鼠肝脏中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白相对表达水平比较

2.3 4 Gy 电子线照射后小鼠肝脏组织胰岛素生长因子相关蛋白表达情况

4 Gy 电子线照射后，Western blot 法检测小鼠肝脏中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白的相对表达水平，结果见图3 和表3。与对照组比较，IGF-1、IGFBP1和IGFBP4蛋白的表达情况相同，与β-actin 积分光密度的比值，在照射后的3个时间点均＜1(均为P＜0.05)；IGF1R 蛋白的积分光密度比值除了在照射后12 h 时＞1，48、72 h 时均＜1(均为P＜0.05)。由此可见，2 Gy电子线照射后，小鼠肝脏中IGF-1、IGFBP1和IGFBP4 蛋白均表达减少。IGF1R 蛋白在照射后12 h点为表达增加，48、72 h点均为表达减少。

图3 Western blot 检测4 Gy 电子线照射后不同时间小鼠肝脏中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白表达情况

表3 4 Gy 电子线照射后不同时间小鼠肝脏中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白相对表达水平比较

3 讨 论

胰岛素样生长因子Ⅰ是多肽类生长因子，与其相应受体IGF-1R 结合可促进细胞分化、增殖等生物学过程，参与机体大部分促生长的代谢活动。因此生命活动的不同阶段内，IGF-1 在机体的大部分组织中均有表达，但主要的合成器官仍是肝脏[9-11]。然而近年来研究发现IGF-1 与炎症及肝纤维化进展有重要关系，在炎症的刺激下，肝细胞超表达IGF-1，IGF-1 促使肝细胞增殖，加强肝脏的合成和代谢功能，从而促进炎症的恢复[12-14]。但肝脏受到长期损害，能够表达IGF-1 的肝细胞减少，故IGF-1 水平降低。因此，肝脏中IGF-1 的含量是肝脏功能好坏的指标之一。同时，由于肝脏是血液循环中IGF-1和IGFBPs的主要来源，肝脏受损时，IGF 系统会发生不同程度的改变，因此肝脏受损对IGF系统的影响也尤为重要。

本课题组前期利用基因芯片对60Co 射线照射的人肝细胞株进行辐射相关基因的筛选，发现胰岛素生长因子家族中的基因差异表达显著。因此选择其为研究对象，对照射后人肝细胞株不同时间胰岛素生长因子基因表达水平的改变进行了分析。本实验从动物水平上观察比较照射后不同时间小鼠肝脏中胰岛素生长因子蛋白的表达情况。通过从照射后不同时间点的角度分析可看出：①电子射线照射剂量为1 Gy时，照射后3个时间点，小鼠肝脏中4种蛋白表达总体呈现为表达减少。其中仅IGF-1 蛋白在照射后48 h 时表达增加，IGFBP1、IGFBP4 和IGF1R 蛋 白 在 照 射 后12、48 和72 h均表达减少。②照射剂量为2 Gy时，照射后3个时间点IGF-1、IGFBP4和IGF1R蛋白表达趋势总体为下调，其中IGF-1、IGFBP4 蛋白在照射后48 h 以及IGFBP1 蛋白在照射后12 h 表达增加，其余时间点均表达减少。IGF1R 蛋白在照射后3 个时间点均呈现为表达减少。③照射剂量为4 Gy 时，照射后3 个时间点，IGF-1、IGFBP1 和IGFBP4 蛋白的表达情况相同，均为表达减少；IGF1R蛋白除了在照射后12 h时表达增加，其余4 个时间点均为表达减少。对比发现照射剂量为2 Gy 时IGF-1、IGFBP1 和IGFBP4 蛋白均出现了表达增加，IGF1R蛋白在照射剂量达到4 Gy时出现了表达增加。此4 种蛋白表达的情况与小鼠肝脏中基因表达情况相同，进一步验证了基因表达的结果，同时也表明电子辐射对胰岛素生长因子体系的影响是错综复杂的，但总体表现为降低这4 种蛋白的表达。

上述4 种蛋白均属于胰岛素生长因子家族中的一员，其中IGF-1 通过与IGF1R 结合来调控各种细胞的增生、分化和凋亡进程，IGFBP1 与IGFBP4 主要用于运输和调节IGF-1，控制IGF-1 运输及代谢，调控IGF-1 定位于特定的组织及细胞上，决定IGF-1 的组织特异性[15-18]。肝细胞为4 种蛋白的主要分泌器官，TUNEL 法检测到照射后6 h，小鼠肝脏细胞出现凋亡，从侧面印证了蛋白的下调表达结果。同时肝细胞在受到放射损伤后会立即进入增殖修复的过程，IGFIR和IGF-1可以促进这一修复过程。而本实验发现照射后IGF-1和IGF-1R蛋白表达下调，会影响到放射性损伤后肝组织的自我修复。

本研究利用Western blot 技术，采用电子线全身照射BALB/c 小鼠，观察比较小鼠肝脏受到不同剂量照射及照射后不同时间点IGF-1R、IGFBP1、IGFBP4和IGF-1 蛋白表达水平的改变。结果表明，4 种基因和蛋白的表达水平基本上以下调表达趋势为主，可为研究辐射对肝脏的早期损伤提供依据，其作用机制有待进一步探讨。