基于TCGA数据库分析肿瘤突变负荷在肌层浸润性膀胱癌预后评估中的价值

石海林，何天基，刘 峰，蔡孟会，葛 波，*

(1．桂林医学院附属医院泌尿外科，广西 桂林541001；2．桂林医学院第二附属医院泌尿外科，广西 桂林 541199)

膀胱癌是常见恶性肿瘤之一，据估计2020 年美国将新确诊81 400 例膀胱癌，同期约有17 980 人死于此疾病[1]，其中肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer，MIBC)(即T 分期≥T2)占比超过25%，在过去的30 多年里其标准治疗方式仍为膀胱癌根治术，但术后的生活质量差，术后5 年生存率小于30%[2]，而随着免疫治疗的不断应用，使得部分肿瘤患者生存率得到较大幅度的提高。免疫治疗的代表药物有PD- 1/PD- L1 等免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)，自2016 年至今，FDA 已批准超过5个ICIs用于部分MIBC/转移性膀胱癌的免疫治疗[3]，临床上多采用检测PD-L1/肿瘤比例评分(tumor proportion score，TPS)的表达来判断和预测免疫治疗的有效性，但其患者疗效反应仍小于25%，因此开发预测免疫疗效的生物标志物成为重要的研究热门方向[4]。肿瘤突变负荷(tumor mutation burden，TMB)是在肿瘤样品中基因的外显子编码区每百万碱基中发生置换和插入/缺失突变的总数[5]，是判断肿瘤免疫治疗疗效的新兴生物标志物，突变总数越多其被免疫系统识别越高，免疫疗效则更佳。研究表明高TMB可提高非小细胞肺癌和乳腺癌等实体瘤免疫治疗的生存期[6-7]，相关研究显示膀胱癌的突变率高居第三，但众多的基因突变与TMB 和免疫应答之间的关系在MIBC 中尚不明确[8-9]，因此本文通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)测序数据分析TMB与免疫应答预后的关系，有望发现可预测MIBC 免疫治疗疗效的生物标志物。

1 材料与方法

1.1 数据获取

TCGA 官网(https://cancergenome.nih.gov/)下载膀胱癌测序数据(V22.0)，得到414 例膀胱癌测序数据和19例正常膀胱组织的数据及相关临床信息，同样从TCGA数据库下载膀胱癌的测序突变数据。

1.2 MIBC的TMB分析

使用R软件中的“maftools”包对所下载的突变数据进行可视化，每个MIBC 样本的TMB 表达量是通过将突变总数/目标编码区域的大小来计算的，通过PERL(https://www.perl.org/get.html)语言提取TMB 的表达量，结合患者的生存时间、生存状态及相关临床信息进行分析；从ImmPort 数据库(https://www.immport.org/)下载参与免疫活动过程的免疫相关基因，结合利用“Limma”包找出高低TMB 分组后的差异表达显著的基因，取两者交集后得到免疫相关基因(设置标准为log2FC＞2及|log2FC|＞2)；采用“Survival”包对得到的差异表达的免疫相关基因进行单、多变量COX回归分析及总生存分析(overall survival，OS)；利用GEPIA2 数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)对差异表达的免疫基因进行无疾病生存分析(disease-free survival，DFS)；将得到COX模型行Kaplan-Meier 生存分析，以曲线下面积(receiver operating characteristic，ROC)判断模型的准确性；最后采用oncomine 数据(https://www.oncomine.org/resource/main.html)跟HPA(https://www.proteinatlas.org/)数据库对OS及DFS均有统计学意义的基因进行验证。

1.3 免疫细胞与TMB亚型之间的相关性

应用CIBERSORT 算法计算浸润免疫细胞的表达量，该算法是采用反卷积算法来计算22种肿瘤中浸润的免疫细胞的表达量[10]，其准确性已通过流式细胞学实验在肝癌、乳腺癌等癌症中验证，当P值＜0.05时认为免疫细胞的表达量差异是有统计学意义的。

1.4 统计学分析

我们以总突变频率数表达量的中位值为标准，将患者分为高、低TMB两组，结合生存状态及时间进行Kaplan-Meier 生存曲线分析，并通过对数秩检验进行比较，采用单因素方差分析、Tukey 多重比较检验和未配对双尾t检验分析临床病理特征与相应TMB 的相关性，单、多因素COX回归分析差异表达的基因进行预后分析。通过未配对t检验评估高TMB 组和低TMB组浸润免疫细胞的差异。具体标准为校正后P值(false discovery rate，FDR)＜0.01 和 差 异 倍 数(fold change，FC)＞2，以α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 MIBC体细胞突变特征

我们通过TCGA 数据库官网下载得到414 例膀胱癌及19 例正常组织信息，其中375 例MIBC 患者(已剔除≤T1的5例及T分期未知的34例)信息，将突变数据可视化后可知超过97%(364/375)MIBC 患者存在突变(图1A)，说明MIBC 突变频率非常高，其中错义突变、无义突变、单核苷酸变异(SNP)和C＞T 突变较多，突变基因排在前10 位的分别为TP53、TTN、KMT2D、MUC16、ARID1A、KDM6A、SYNE1、PIK3CA、RB1、RYR2，见图1B～G。

2.2 MIBC的TMB生存预后及临床相关性

以375 例MIBC 患者TMB 中位值分为两组，其中低TMB 组为184 例，高TMB 组191 例，采用R 软件的Survival 包行Kaplan-Meier 分析评价TMB 在MIBC 中与生存预后的相关性，可知高TMB 组患者生存期较低TMB组更长(P＜0.01)，说明高TMB可能使MIBC患者接受免疫治疗效果更佳。MIBC 患者结合相关临床信息进行相关性分析可知，在年龄分组(65 岁为界)、性别、肿瘤组织学分级(高低级)各组之间的TMB 表达量差异明显，均具有统计学意义(P＜0.05)，而TMB 的表达与MIBC 患者吸烟、TNM 分期、临床分期等未见明显相关关系(P＞0.05)(图2A～D)。另外按TMB 表达量进行分组，利用Limma 包进行分析，Pheatmap 包进行可视化，得到231 个差异表达的基因。将差异表达基因结合ImmPort 数据库下载得到的2 498 个免疫功能基因，取交集后得到75 个具有差异表达的免疫功能基因，再对预后因素进行单因素COX 回归分析得到12个与预后密切相关的免疫功能基因(CD1A、IFNG、KIR2DL4、CXCL14、CXCL11、MARCO、CMA1、CRH、NRG1、RLN1、IL1RL1、SSTR5)，然后进行多因素COX 回 归 得 到 高 表 达SSTR5[95%CI(0.304，0.918)]、KIR2DL4[95%CI(0.481，0.917)]的患者生存预后更佳，而低表达IL1RL1[95%CI(1.023，1.436)]的患者预后更佳(P＜0.05，图2E～G)。

图1 MIBC遗传突变

图2 TMB预后分析与临床信息的相关性分析

2.3 免疫基因的数据库验证

GEPIA2 数据库结果提示高表达KIR2DL4及低表达白介素1 受体样1(IL1RL1)的患者无疾病生存期更长，差异有统计学意义(P＜0.05)(图3A 和3B)；以环状肽激素生长抑素受体(SSTR5)、KIR2DL4及IL1RL1构建的COX 风险模型得到低风险组生存时间更长(P＜0.001)，ROC为0.71，表明该模型准确性较好(图3C和3D)。将KIR2DL4和IL1RL1免疫相关基因分别在Oncomine及HPA数据库进行验证，KIR2DL4基因及其所编码的蛋白在肿瘤组织中明显高表达，而IL1RL1及其编码的蛋白在MIBC 染色强度显著低于癌旁组织，得到IL1RL1在MIBC 组织中的表达显著下调，差异有统计学意义(P＜0.05，图3E和3F)。

2.4 TMB富集分析

将所得到的差异表达基因进行富集分析，用“Limma”包分析TMB 相关的MIBC 差异表达基因，得到上调基因83 个，下调基因148 个。通过GO(gene ontology)功能富集分析可知在生物过程(molecular function，BP)中主要为体外配对组织、第二信使介导、淋巴细胞趋化性、白细胞正性调节等功能；细胞成分(cellular component，CC)中主要为内质网内腔、囊腔等；分子功能(biological process，MF)中主要为受体配体活性、肌动蛋白结合、糖胺聚糖结合、生长因子活性等功能(图4A)，表明相关基因深度参与机体的免疫反应。在KEGG 富集分析中确定差异表达基因最丰富的途径，包括细胞因子细胞蛋白受体内含子、趋化因子信号通路、钙信号通路、cGMP-PKG 信号通路、肿瘤相关通路等(图4B)。

图3 免疫基因的数据库验证

图4 TCGA数据库中MIBC基因富集图

2.5 TMB与免疫细胞相关性

在肿瘤突变过程中往往形成更多的新抗原，使肿瘤具有更高的免疫原性。GO 富集分析表明差异表达基因参与肿瘤微环境的免疫过程，但肿瘤微环境中免疫细胞众多，我们可以采用CIBERSORT 算法计算浸润免疫细胞的分数，结果表明，与正常膀胱组织比较，高TMB 组的肿瘤CD8+T 细胞、活化的CD4+T 细胞、嗜酸性粒细胞表达较高，而在低TMB 组中记忆B细胞及未活化的肥大细胞表达比例较高，差异有统计学意义(P＜0.05，图5)。

图5 高、低TMB组与浸润免疫细胞的相关性

3 讨 论

肿瘤的发生是体细胞突变不断积累的结果，突变的类型主要包括非同义突变、同义突变、插入或删除和碱基错配，实际上在肿瘤的发生发展过程中基本都具有非同义突变，在不同的肿瘤类型中遗传改变的频率有明显的差异，由于突变后会增加免疫原性，但为避免被免疫系统检测并清除，因此肿瘤往往上调免疫检查点[11]。而驱动基因突变可以导致肿瘤的发生，使大量的体细胞突变可以产生新抗原，新抗原可以激活CD8+的细胞毒性T 细胞，从而发挥T 细胞介导的抗肿瘤效应。因此，当基因变异数目累积增多时，就会产生更多的新抗原，进而被免疫系统识别的可能性就越大，对于免疫治疗，癌细胞TMB越高，可能产生的新抗原越多，肿瘤的抗原免疫原性越高，T 细胞反应和抗肿瘤反应越强，更加适合免疫治疗[12]；既往研究显示，在接受PD-1/PD-L1 免疫检查点抑制剂治疗的患者，与TMB密切相关的非同义突变数量与肿瘤的客观缓解率(ORR)、持续临床获益时间及无进展生存期(PFS)的改善均呈正相关；TMB 最初是在使用Ipilimumab 或Tremelimumab 治疗晚期黑色素瘤患者时作为预测疗效的生物标记物，发现拥有高水平TMB的黑素色瘤和非小细胞肺癌患者对PD-1/PD-L1 免疫检查点抑制剂的疗效往往高于低水平TMB 表达的患者[13]。当前研究大多只将TCGA 膀胱癌数据粗略进行分析，但尚未有单独进行MIBC的研究，TCGA数据库在TNM 分期上以MIBC 患者占大多数，因此MIBC 与TMB 的关系尚不清楚[14-15]。本次研究375 例MIBC 患者中97%患者存在突变，说明MIBC 患者中突变频率非常高，其中错义突变、无义突变、单核苷酸变异(SNP)和C＞T 突变占较多，最常见的5 个突变基因是TP53、TTN、KMT2D、MUC16和ARID1A。TP53是 抑 癌 基因，通过调节细胞周期从而抑制肿瘤的发生发展[16]；TTN为编码肌节的肌联蛋白基因，与扩张型心肌病可能存在关联，但在肿瘤发生过程的作用尚有待进一步研究[17]；KMT2D是一种调节肿瘤生长和转移的相关蛋白，在膀胱癌中，KMT2D作为肿瘤抑制因子，其突变可导致肿瘤细胞的存活、迁移和侵袭[18]；MUC16是一种跨膜蛋白，可能参与肿瘤的转移[19]；ARID1A(AT 丰富结合域1A)基因，是染色质重塑复合物SWI/SNF 的核心亚基，参与DNA复制、转录、修复等过程，并和组蛋白共价修饰复合物等进行染色质重塑，与抑制肿瘤发生发展相关，有研究数据表明，当ARID1A 发生失活变异时，可导致错配修复(MMR)蛋白功能被削弱，具有致癌作用，ARID1A 失活突变可导致TMB 升高，促进CD8+T 细胞浸润和PD-L1 表达，提示失活突变所导致的免疫微环境变化更利于免疫治疗[20]。因此，TMB水平高的患者产生新抗原多，肿瘤会被大量特异性T细胞攻击，抗PD-1治疗可以使肿瘤T细胞反应得以更充分的发挥，因此高水平TMB的肿瘤患者对抗PD-1 治疗更敏感，TMB 已经被证明与ICIs 治疗黑色素瘤、肺癌等的临床疗效相关，被认为是各种类型免疫治疗反应的独立预测因子，相关临床指南也推荐TMB可作为预测免疫治疗的标志物[21]。

在本研究中，我们发现375例MIBC患者中高水平TMB 会影响MIBC 的预后，可增强免疫治疗效能，高TMB可能反映了存在突变相关的新抗原，可增加淋巴细胞在肿瘤微环境中的浸润，从而提高免疫抗肿瘤效应，这与靶向药物的有效性和临床结果密切相关[22]。随着年龄的增长、男性患者及肿瘤分级较高的MIBC患者TMB 较高；年龄增长导致体细胞突变频率更高，而男性患者可能因较多雄激素而出现TMB升高，但还有待进一步研究。另外我们还在低TMB组和高TMB组之间鉴定出了231 个差异表达基因(83 个上调和148 个下调)，其中高表达SSTR5、KIR2DL4的患者生存预后更佳，而低表达IL1RL1的患者预后可能较佳，并进行GO跟KEGG富集分析，发现许多基因涉及免疫应答和趋化因子信号通路，这些结果表明，TMB及这些TMB相关基因与肿瘤微环境的变化密切相关[23-24]。SSTR5广泛分布于人体的所有组织中，通过改变第二信使(如cAMP)的水平，或通过激活离子通道，改变细胞内钙水平来实现抗增殖作用，从而导致蛋白酪氨酸磷酸酶诱导细胞周期停滞或凋亡抑或通过抑制生长因子的释放来实现肿瘤抑制，当SSTR5 高表达时可抑制肿瘤生长[25]。自然杀伤(NK)细胞表面的免疫球蛋白样受体2DL4(KIR2DL4)，抑制其与配体人白细胞抗原G 的结合增强NK细胞的杀伤功能从而抑制细胞增殖[26-27]。白介素1 受体样1(IL1RL1)由328 个氨基酸组成，可被促炎因子刺激诱导，并可能参与辅助T 细胞的功能，与白细胞介素1受体I型(IL1R1)、II型(IL1R2)和白细胞介素1受体样2(IL1RL2)在2q12染色体上形成细胞因子受体基因簇，该基因的可变剪接导致多个转录本变异，参与机体多种炎性免疫反应，与肿瘤的发生和侵袭转移密切相关，通过影响肿瘤免疫微环境，并可能直接在肿瘤细胞表面表达而直接影响细胞的生物学行为，其在肿瘤中的具体作用机制还需进一步研究[28]。

肿瘤中免疫细胞浸润是肿瘤的一个特征，许多恶性肿瘤都有一个复杂的趋化因子网络，影响这种免疫细胞的程度和表型，以促进肿瘤细胞的生长、转移[27]。在本研究中，我们发现，与正常膀胱细胞相比，高TMB组的MIBC中CD8+T细胞、活化的CD4+T细胞、嗜酸性粒细胞表达较高，而在低TMB组中记忆B 细胞及未活化的肥大细胞表达比例较高，这与目前相关研究基本一致，但需大规模实验验证[28]。这些结果表明TMB能影响免疫细胞的浸润，新抗原可吸引免疫系统的效应细胞；因此，建立一个癌症-免疫系统平衡对机体保持健康至关重要。CD8+T细胞在特定条件下可分化为裂解效应细胞，增加γ-干扰素(IFNγ)、Fas 配体(FASL)、颗粒B 的表达，抑制肿瘤细胞增殖[29]。肿瘤微环境中T淋巴细胞的高浸润与MIBC患者生存呈正相关，嗜酸性粒细胞参与介导组织损伤修复，维持内环境的稳定等多种功能，其所分泌的多种细胞因子与肿瘤的发生、发展及转移密切相关[30-31]；而肥大细胞可能有助于肿瘤血管生成，在肿瘤生长中起重要作用，低TMB组肥大细胞可促进肿瘤生长和转移，但高TMB 中产生新的抗原可能干扰肿瘤增殖[32]，这些研究表明TMB的水平高低与免疫微环境变化密切相关。

本研究通过TCGA 数据库分析表明免疫治疗在高TMB 的MIBC 患者中可能具有较好的预后，存在较大的潜在临床应用价值；发现了可能影响免疫细胞浸润的TMB 相关基因，初步解析免疫细胞在MIBC 肿瘤微环境中的差异表达，以此为MIBC 的免疫治疗在临床上的应用提供理论基础，但尚需更大规模、前瞻性、多中心的实验研究进一步证实。