盐津乌骨鸡mtDNA D-loop区遗传多样性及其保种效果分析

王荣琼，孙利民，胡 瑀，滕晓红，邱立华，苗永旺*

(1. 云南农业职业技术学院 畜牧兽医学院，云南 昆明 650212；2. 云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明650201；3. 云南省畜牧总站，云南 昆明 650225)

盐津乌骨鸡(Yanjin black-bone chicken)因主产于云南省昭通市盐津县而定名，属肉蛋兼用型地方鸡种，具有适应性好、耐粗饲、抗病力强、肉嫩味美，营养和药用价值高等优良种质特性，是宝贵的地方畜禽遗传资源[1-2]。研究表明，盐津乌骨鸡群体内的遗传变异较大，近交程度弱，遗传多样性很丰富，选育潜力较大，属于未经系统选育的地方品种[3-5]。

线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)积累的突变比核基因高数倍，其D-loop 区的突变速度又较其它区域高。由于D-loop积累的突变多，因此该区域DNA序列是进行种下水平遗传多样性和群体遗传组成分析的理想遗传标记，效果好、灵敏度高[6]。近年，采用D-loop标记，已对家鸡及其野生近缘种红原鸡的世系组成及其地理分布进行了深入研究[7-9]。本研究利用适合进行种下水平遗传多样性分析的mtDNA D-loop区序列为遗传标记，采用 PCR产物直接测序技术，进行群体变异检测和群体遗传学分析，以探讨盐津乌骨鸡的群体遗传变异、遗传组成的动态变化，为盐津乌骨鸡资源的保种和育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2005年本实验室在云南省盐津县的牛寨、盐井等保种区采集了79只盐津乌骨鸡(♂：30，♀：49)的血液样品(YJ2005)。2018年在云南省盐津县盐津乌骨鸡保种场采集60只盐津乌骨鸡的血液样品，公母各半(YJ2018)。每只鸡采静脉血1 mL，与等量DNA保存液混合后，低温带回实验室，用于实验室检测分析。为了与云南其他地方鸡进行比较，本实验室已发表的云南其他地方鸡11个群体的647条mtDNA D-loop区序列用于本研究数据分析[10-15]。

1.2 基因组DNA的提取

基因组DNA的提取参照苗永旺等[16]所示方法。然后，使用NanoDrop 2000UV-VIS分光光度计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)测定其浓度和纯度，稀释成100 ng/μL。

1.3 PCR扩增及序列测定

目的片段扩增及测序所需引物相同，参照FUMIHITO等[6](正向引物：5'-AGGACTACGGCTTGAAAAGC-3'；反向引物：5'-ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG-3')，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR体系及操作程序参照LIU等[7]。PCR反应体系总体积为25 μL，含模板DNA(50～100 ng)1 μL，ddH2O 19.375 μL，10×Buffer 2.5μL(Mg2+浓度15 mM)，dNTP(各2.5 mM)1 μL，正、反向引物(20 μM)各0.5 μL，Taq酶(TaKaRa公司)0.125 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；然后94 ℃ 1 min，63 ℃ 1min，72 ℃ 1 min，运行35个循环；再72 ℃延伸5 min，最后4 ℃终止反应。PCR产物经琼脂糖凝胶(1.5%)电泳检测后，进行回收纯化，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向直接测序。

1.4 数据统计分析

所获序列经人工检查核对后，以.seq格式输出，利用ClustalX软件对所得序列进行序列比对，然后，采用DnaSP6软件进行群体变异位点、DNA多态性、基因流(gene flow)和群体间遗传分化、遗传距离等的计算和输出。用MEGA6软件估算整个群体的平均遗传多样性，进行单倍型输出和群体单倍型世系组成(群体遗传组成)分析，并基于云南地方鸡群体间的遗传分化指数，采用邻接法(Neighbor-jointing, NJ) 构建聚类树。采用Network 5.0软件构建单倍型Median-joining网络关系图。

2 结果与分析

2.1 序列变异分析

本研究扩增片段长539 bp，为家鸡mtDNA D-loop区第I高变区序列。去掉两侧测序质量较差的序列后，用于本研究的序列长度为520 bp。在所分析的2005年样品序列中，碱基T、C、A和G平均含量分别为30.2%、29.8%、27.4%和12.7%；共检测到40个核苷酸多态位点，占检测核苷酸位点总数的7.69%。序列中未发现插入/缺失，核苷酸的变异主要为转换，转换颠换比为10.94。在发现的40个多态位点中，单一信息位点8个，简约信息位点32个，共定义了27种单倍型，其中H19、H02、H03、H13单倍型在群体中分布较多，比例分别为13.92%，11.39%，11.39%和8.86%(图1)。在所检测的2018年样品序列中，碱基T、C、A和G平均含量分别为30.1%、29.9%、27.3%和12.7%；共检测到24个核苷酸多态位点，占检测核苷酸位点总数的4.62%，其中5个为单一信息位点，19个为简约信息位点。在群体中共检测到13种单倍型，其中H13、H02、H15单倍型在群体中分布较多，比例分别为28.33%，21.67%和13.33%。

两个年度相比，2018年采集样品中单倍型数量大幅度减少，2005年采集样品中的18种单倍型在2018年采集样品中未检测到，在2018年样品所发现的13种单倍型中，只有9种出现在2005年采集的样品中，其余4种为新出现的单倍型(包括3种E世系单倍型和1种A世系单倍型)。由表1可见，与已检测的云南其他地方鸡相比，YJ2005群体遗传多样性水平较高，YJ2018群体遗传多样性水平较低。

2.2 群体遗传分化

将本研究数据与已发表的11个云南地方鸡数据合并，估算出云南地方鸡各群体间平均遗传分化指数(Fst)为0.14113，群体间基因流Nm=3.04。

表1 云南12个地方鸡群体的遗传多样性Table 1 Genetic Diversity in 12 indigenous chickens in Yunnan

云南地方鸡群体间的Fst在0.0000～0.5874之间；兰坪绒毛鸡与其它云南地方鸡群体间遗传分化最大，而武定鸡与西畴乌骨鸡，华坪乌骨鸡与他留乌骨鸡、普洱毛脚乌鸡，他留乌骨鸡与普洱毛脚乌鸡间遗传分化最小。YJ2005与YJ2018之间Fst=0.073，在各群体之间处于中等位置。YJ2018与云南其他地方鸡的Fst值在0.02055～0.56494之间，与云龙矮脚鸡遗传分化最小，与兰坪绒毛鸡遗传分化最大；YJ2005与云南其他地方鸡的Fst值在0.0000～0.46732之间，与他留乌骨鸡、南涧绿耳乌鸡、普洱毛脚乌鸡间遗传分化最小，与兰坪绒毛鸡遗传分化最大。基于云南地方鸡群体间的遗传分化指数构建的聚类树见图2。

2.3 世系组成与系统发育关系

按照已有的家鸡mtDNA母系世系划分方式[7-8]，将本研究及已发表的数据进行世系划分，结果见表2。云南地方鸡群体的mtDNA母系世系血统含有3～7个不等。与已检测的云南其他地方鸡相比，盐津乌骨鸡群体世系组成与云南本地其他鸡种明显不同(表2)。其单倍型H01和H02属于B世系(命名为B01、B02)，单倍型H03～H11属于A世系(命名为A01～A09)；单倍型H12属于C世系(命名为C01)；单倍型H13～H17属于E世系(命名为E01～E05)；H18单倍型属于F世系(命名为F01)；单倍型H19～H31属于G世系(命名为G01～G13)(图1)。YJ2005的27个单倍型可划分到A、B、C、E、F和G 6个世系中。YJ2018的13个单倍型可划分到A、B、E和G 4个母系世系中。

基于本研究盐津乌骨鸡mtDNA D-loop所有序列构建的单倍型中介网络图，见图3。在单倍型网络图中，本文分析的所有个体均可划分到A、B、C、E、F和G 6个母系世系中。网络图遗传关系显示，6个母系世系之间相距至少6步以上变异，揭示它们之间有较大的遗传分化。由图3可见，A世系和G世系呈典型的星形分布；YJ2018缺少C、F世系，其单倍型只分布在A、B、E和G世系中，且在E世系中拥有的单倍型及个体数量均较多。

表2 云南地方鸡群体的母系世系构成比Table 2 Clade composition ratio in 12 Yunnan local chickens

3 讨 论

本研究对2005年采集的79只盐津乌骨鸡样品和2018年采集的60只盐津乌骨鸡样品分别进行了群体变异检测和群体遗传学分析。两个年度的样品相比，在突变为点数、单倍型数、单倍型多样度、核苷酸多样度和群体内遗传距离等指标上，2018年采集的盐津乌骨鸡样品均显著降低。一般核苷酸多样度不受样本含量的影响，是衡量群体遗传多样性的主要指标[6]。在云南地方鸡群体中，兰坪绒毛鸡遗传多样性最低，其次为2018年采集的盐津乌骨鸡样品。由此，揭示2018年的盐津乌骨鸡保种群内遗传变异比2005年的保种群内遗传变异显著降低，且低于云南大部分地方鸡种[10-15]，揭示该鸡保种群遗传基础变得狭窄，保种效果不佳。

群体遗传分化分析显示，云南地方鸡群体间存在不同程度的遗传分化，其中，兰坪绒毛鸡与云南其他地方鸡群体间遗传分化最大。2005年采集的盐津乌骨鸡样品和2018年采集的盐津乌骨鸡之间已存在较大遗传分化。它们之间的遗传分化已大于云南一些其他地方鸡之间的遗传分化，揭示该鸡保种群的遗传组成已发生改变。

近年研究显示，家鸡是多个母系起源的，世界家鸡和红原鸡的mtDNA母系世系可划分为A、B、C、D、E、F、G、H和I等世系，其中，A和B世系在中国、日本和东南亚等地的地方鸡中普遍存在，C世系为中国黄淮流域地区地方鸡所特有，F、G和H世系为云南及邻近地区地方鸡所特有，而E世系在印度和欧洲家鸡中出现频率较高[7-8]。本研究2005年采集的盐津乌骨鸡样品按照已有的划分标准可分为A、B、C、E、F和G 6个母系世系世系，相对应的单倍型也分布在网络图的5个大枝上，G和A世系在2005年采集的样品中占优势(73.41%)，群体中云南特有世系F和G占44.30%；而2018年采集的盐津乌骨鸡样品只能划分到A、B、E和G 4个母系世系中，且出现了2005年采集的样品中没有的3个E世系单倍型(图1)，群体中E世系所占比例高达50%。以上结果揭示，2018年采集的盐津乌骨鸡样品在群体遗传组成上与2005年采集的盐津乌骨鸡样品已存在较大差异，C和F世系已经丢失；2018年采集的样品中尚存的A、B、E和G 4个母系世系在群体中所占的比例与2005年采集的样品也不相同，特别是属于印度和欧洲家鸡中普遍存在的E世系血统由原来的10.13%上升到了50%，E世系有多个新单倍型渗入。以上揭示盐津乌骨鸡保种群受到了较大比例的欧美商品鸡血液渗入的影响。

本研究结果表明，2018年的盐津乌骨鸡保种群遗传多样性显著降低，群体遗传组成与2005年相比发生了较大变化，特别是保种群受到了较大比例的欧美商品鸡血液的渗入，提示该鸡存在近交和导入外血的过程，保种效果不佳。保种群在保种过程中应保持其遗传基础和群体遗传结构保持不变；如果群体遗传结构发生较大变化和外来血统渗入，保种就没有达到目的。

4 结 论

本研究结果表明，盐津乌骨鸡保种群遗传多样性水平2018年较2005年明显降低，遗传基础变得狭窄，具有A、B、E和G 4个母系血统来源，母系血统和变异类型减少，推测存在较大比例的欧美商品鸡的血液渗入，揭示该群体保种效果不佳。