苜蓿细胞周期蛋白CYCD5;1基因表达及其调控秋眠性机理研究

杜红旗,房卫平,娄治国,徐照学,冯长松*

(1.河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州 450008；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450008；3.河南省农业科学院 经济作物研究所，河南 郑州 450008)

秋眠型苜蓿品种秋季生长缓慢、叶小和茎纤细匍匐，但具有较强的抗寒性和较高的越冬能力[1-2]。筛选调控苜蓿秋眠性候选基因时发现Maverick苜蓿叶片中Cyclin-D5;1基因(CycD5;1)在秋季9月份时的表达量显著高于春季5月份时的表达量(P<0.01)[3]，因此推测CycD5;1基因的高表达可能参与苜蓿的秋眠。CycD5;1属于植物D型细胞周期蛋白中的一个。植物D型细胞周期蛋白包括N末端和/或C末端的PEST基元(motif)，以及Rb结合基元(LxCxE)[4]。基于在系统演化上的位置，D型细胞周期蛋白可以细分成CycD1、CycD2、CycD3、CycD4、CycD5、CycD6 和CycD7 等多个亚类[5]。D型细胞周期蛋白通过形成细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的调节亚单位在细胞周期对外界信号的反应中发挥重要作用[6]，它们作为连接与细胞分裂活性相关的外部和内部生长信号的主要传感器[7]，被认为是从G1期早期(甚至G0期)开始调控细胞循环的进展来响应外部生长信号[8]，其调控细胞循环的机理可能是：在对生物和非生物胁迫信号的响应下它们直接作用于CycD/CDK复合物的信号级联来阻止细胞周期，CycD/CDK复合物和EL2样蛋白之间的平衡可能是决定细胞分裂与否的一个关键参数[7]。研究表明，CycDs的表达受植物激素调控，特别是受生长激素IAA的调控，CycDs的增加可激活或促进细胞分裂[9]，但是它们受环境因子调控的研究未见报道。

CycD5;1属于CycD5的一种，是一个数量性状基因，CycD5;1在核内复制过程中作为核内复制限速因子，CycD5;1的过表达和沉默均能有效地改变DNA倍性水平，它通过调节叶片发育过程中连续内循环的进程来控制自然界的内倍体，种群结构与CycD5;1遗传变异的部分混淆产生了一种适应环境梯度变化的机制，这种机制导致在广泛地理范围内的差异内多倍体和器官生长[10]。CycD5;1是活性激酶复合物(CycD/CDK)重要组成蛋白，这些复合物诱导分化烟草(NicotianatabacumL.)表皮细胞分裂、促进拟南芥(Arabidopsisthaliana)细胞增殖[11]。在拟南芥中CycD5;1高表达可以增加叶片细胞数和减少细胞体积，这可能是有丝分裂活性高于内循环活性的结果；而其低表达使叶片细胞数减少而细胞大小基本不变[10]。

目前，CycD5;1基因的研究主要集中在拟南芥、烟草和玉米(Zea mays)上，苜蓿CycD5;1的研究仅见前期筛选调控苜蓿秋眠性候选基因中的报道，对其研究还很不深入，因此本研究通过检测春夏秋季和人工条件下不同光照时间或温度下秋眠型苜蓿品种Maverick叶片中CycD5;1 mRNA相对表达量，分析其在苜蓿秋眠中的作用及其调控秋眠性的机理，以期为苜蓿分子育种提供功能基因和理论基础。

1 材料与方法

1.1 大田试验

选用美国苜蓿标准秋眠1级品种Maverick作为试验品种，2010年9月播种于郑州惠济区的砂质壤土中，按照常规苜蓿种植管理办法进行种植管理。第一次取样是苜蓿春季返青后4月份取样，以后5月份到10月份期间每次刈割后第14天取样，每次均是在上午8:00开始采集，采集至少三株苜蓿植株分枝顶端第一个成熟叶片以下的第3～5片成熟叶片，取后放置液氮中，之后再存于-80 ℃冰箱待用。每次取样需要记录当月的日照长度和温度；随机选取5株苜蓿并随机选取10片叶片测长和宽，采用曹亦芬等建立的A=KLW (A：叶面积；K：修正系数；L：叶长；W：叶宽)公式和纠正系数(根据长宽的数值选用适合的纠正系数)计算叶面积[12]；同样，随机选取15株苜蓿植株并测每株高、中、低枝条的高度，取其平均值作为该苜蓿株的株高。

1.2 人工条件处理试验

紫花苜蓿为长日照植物，日照长度长于14 h开花，在夏末秋初日照长度短于11 h时它会发生明显秋眠，因此日照长度设置为：8 h、12 h、16 h；紫花苜蓿最适生长发育温度是15～25 ℃，并且气温高于30 ℃植株生长受阻，高于35 ℃植株萎蔫甚至死亡，因此温度设置为16 ℃、24 ℃和32 ℃。紫花苜蓿品种Maverick植株共分为6组，每组各3株苜蓿植株。其中3组分别在温度均为24 ℃、光照强度均为3 000 lux，每天光照时间分别为8 h、12 h和16 h下培养。另外3组在光照强度均为3 000 lux、每天光照时间均为16 h，温度分别为16 ℃,24 ℃和32 ℃下培养。每种处理均是刈割后开始处理，处理14 d后取各自的叶片并储存于-80 ℃冰箱待用。

1.3 总RNA提取以及反转录

所取样品严格按照TRizol法操作步骤(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取各样品的总RNA，并应用Nano2000核酸检测仪器检测各样品RNA的浓度后均调至500 ng/μL的浓度，取2 μL的各样品RNA严格按照反转录试剂盒的操作步骤(TAKARA公司)进行反转录。

1.4 CycD5;1 mRNA相对含量检测

前期转录组测序得到的CycD5;1部分序列在NCBI数据库中序列比对进行基因注释、保守序列分析和各外显子界限的分析，根据序列分析结果应用primer5.0软件按照荧光定量引物设计原则设计CycD5;1荧光定量引物(CycD5;1-S：ACAGAAATAGACCAAGAGGGAGA，CycD5;1-A：CAGGGCAGAACAAGTAAACAAAG)，紫花苜蓿GAPDH荧光引物为GAPDH-S：TGGGAAGCACATTACAGCAG，GAPDH-A：CATCAGCATTGACACCAACC[3]，应用罗氏SYBER green荧光染料在罗氏Cycler9.0荧光PCR仪上检测各样品中CYCD5;1 mRNA相对表达量。

1.5 统计学分析

依据荧光定量PCR检测的CycD5;1和GAPDH的Ct值，采用2-ΔΔCt公式计算CycD5;1 mRNA相对表达量，用平均值±标准差表示[13]。应用SPSS 19.0(IBM Corp., USA)软件中one-way ANOVA方法、双因子相关性分析和双边T检验方法对所测日照长度、温度、株高、叶面积和各样品间CycD5;1 mRNA相对表达量数据进行差异显著性和相关性分析。最后，应用GraphPad prism 5(GraphPad Software,Inc, USA)软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 采样时期日照长度和温度

从4月份至10月份的日照长度和温度均呈现先升高后降低的变化趋势。从4月份至6月份的夏至日照长度逐渐延长，之后逐渐缩短；从4月份至7月份温度逐渐升高，之后逐渐下降(图1)。

2.2 Maverick苜蓿株高和叶面积

从5月份至10月份，Maverick苜蓿的株高逐渐下降，但4-8月份Maverick苜蓿株高差异没有达到显著水平(P>0.05)，9、10月份时的Maverick苜蓿株高极显著低于4-8月份的株高(P<0.01)(图2)，表明Maverick品种苜蓿在秋季发生秋眠时株高显著降低；8-10月份Maverick苜蓿叶面积显著小于其它月份的叶面积(P<0.05),表明秋季Maverick苜蓿秋眠时的叶面积显著变小(图3)。

2.3 CycD5;1基因mRNA 相对表达量

由图4可见，自然条件下，CycD5;1 mRNA 相对表达量基本呈现4-7月份逐渐减少，7-10月份逐渐升高的趋势，其中7月份含量最低9月份时的CycD5;1 mRNA相对表达量显著高于6、7、8月份时的相对表达量(P<0.05)，10月份的CycD5;1 mRNA相对表达量极显著高于6、7、8月份时的相对表达量(P<0.01)。

人工气候条件下，随着光照时间的增加，Maverick苜蓿叶片中CycD5;1 mRNA相对表达量逐渐增加,光照时间8 h时的Maverick苜蓿叶片CycD5;1 mRNA相对表达量极显著低于12 h和16 h时的相对表达量(P<0.01)；光照时间12 h时的Maverick苜蓿叶片CycD5;1 mRNA相对表达量极显著低于16 h时的相对表达量(P<0.01)(图5)。

随着温度的升高，秋眠型苜蓿Maverick叶片中CycD5;1 mRNA相对表达量逐渐降低，其中16 ℃下秋眠型苜蓿Maverick叶片中CycD5;1 mRNA相对表达量极显著高于24 ℃和32 ℃下CycD5;1 mRNA相对表达量(P<0.01)(图6)。

2.4 CycD5;1 mRNA 相对表达量、苜蓿表观参数、环境因子之间的相关性

由表1可见，自然条件下,秋眠型苜蓿Maverick叶中CycD5;1 mRNA相对表达量变化与温度显著中度负相关(P<0.05),与日照长度显著高度负相关(P<0.05)。但在人工气候条件下,秋眠型苜蓿Maverick叶中CycD5;1 mRNA相对表达量变化与日照长度极显著高度正相关(P<0.01)、与温度极显著高度负相关(P<0.01)。自然条件下，秋眠型苜蓿Maverick叶中CycD5;1 mRNA相对表达量与叶面积、株高呈显著中度负相关(P<0.05)。

表1 CycD5;1 mRNA相对表达量、苜蓿表现号数、环境因子之间的相关性Table 1 Correlation between CycD5;1 mRNA relative abundance in the leaves of Maverick and day length and temperature

3 讨 论

秋眠型苜蓿在秋季发生秋眠时再生高度和叶面积显著低于未秋眠时的再生高度和叶面积,但是目前苜蓿秋眠性的分子机理不清楚。本研究表明秋眠型苜蓿Maverick叶片中CycD5;1基因的表达受日照长度的正调控、受温度负调控，其中，温度是调控其表达的关键环境因子，秋眠型苜蓿MaverickCycD5;1基因的高表达很可能在减小其叶面积、降低其株高中发挥重要作用而参与调控苜蓿的秋眠。

3.1 Maverick叶片CycD5;1基因表达

在人工条件下秋眠型苜蓿Maverick叶片中CycD5;1基因表达受日照长度和温度调控的趋势相反，温度负调控CycD5;1基因表达，温度的降低上调CycD5;1基因表达；自然条件下,秋眠型苜蓿Maverick叶片中CycD5;1 mRNA相对表达量与日照长度和温度显著负相关(表1)；由此可得：人工条件和自然条件下日照长度与秋眠型苜蓿Maverick叶中CycD5;1 mRNA相对表达量相关性相反，而人工条件和自然条件下的温度与秋眠型苜蓿Maverick叶中CycD5;1 mRNA相对表达量相关性相同，并且自然条件下日照长度和温度与秋眠型苜蓿Maverick叶中CycD5;1 mRNA相对表达量的相关性一致,因此秋眠型苜蓿Maverick叶片中CycD5;1基因的表达主要受温度的调控。秋眠型苜蓿最初引自寒冷气候地区、具有很好的抗寒性，适合于寒冷气候的地区生长；它们形成了适应环境的调控方式，并且秋眠型苜蓿有其独特的遗传背景和遗传多样性[14]，Sterken等[10]研究表明：CycD5;1的遗传变异参与植物适应环境梯度变化的机制，因此CycD5;1很可能参与秋眠型苜蓿抗寒性强的特性，这也可能是它的表达主要受温度调控的原因。

秋眠型苜蓿Maverick叶片中CycD5;1基因表达主要受温度的调控是直接还是间接的呢？Aurora等[9]研究表明：CycDs的表达受植物激素调控，特别是受生长激素IAA的调控，温度通过改变植物激素作用来影响植物生命活动。以此推测秋眠型苜蓿Maverick叶片中CycD5;1基因的表达受温度的调控很可能是通过植物激素间接调控的。

3.2 CycD5;1基因调控苜蓿秋眠的机理

温度是调控苜蓿秋眠性的环境因子[15]，从夏末至秋季随着温度的降低秋眠型苜蓿发生秋眠，秋眠型苜蓿Maverick叶片中CycD5;1基因的表达主要受温度的调控，温度的降低导致秋眠型苜蓿叶片中CycD5;1基因mRNA相对表达量升高(图4、图6)，并且秋眠型苜蓿Maverick叶片中CycD5;1基因mRNA相对表达量与其株高和叶面积显著负相关(表1)，所以秋季时秋眠型苜蓿叶片中CycD5;1基因的高表达很可能参与降低株高和减少叶面积。株高和叶面积都被认为是苜蓿秋眠性的重要指标[16-17]。叶面积是叶片细胞周期、分裂和生长的宏观表现，细胞周期的调节与整个器官生长速率的变化有着直接的联系,细胞周期、分裂和生长受细胞和环境因素之间空间关系的调节[18-19]，叶片大小受细胞周期、分裂和生长相关基因表达变异的影响[20]。CycD5;1属于植物D 型细胞周期蛋白之一，是活性激酶复合物(CycD/CDK)重要组成蛋白，这些复合物在调控细胞周期、细胞分裂中起着关键作用。本研究表明：秋眠型苜蓿叶片中CycD5;1基因的高表达减小了叶面积。苜蓿叶面积的减小减弱了叶片光合作用、呼吸作用和蒸腾作用，从而减慢了整个植株的生长，可能导致了苜蓿株高的降低。

综上所述，CycD5;1基因调控苜蓿秋眠的机理可能是：从夏季至秋季随着温度的降低，CycD5;1基因表达的上调减慢了细胞周期和细胞分裂，从而使叶面积减小、叶片光合作用、呼吸作用和蒸腾作用减弱，从而减慢了整个植株的生长而发生秋眠。但在拟南芥中CycD5;1高表达增加叶片细胞数和减少细胞体积，沉默CycD5;1拟南芥植株能减少叶片细胞数和减少细胞体积[10]，说明CycD5;1基因的高表达可能增加了叶面积和促进了细胞周期和细胞分裂，这与本研究的结果相反。可能的原因是不同的物种间CycD5;1参与适应环境梯度变化的机制不同，不同物种的CycD5;1的功能有差异。

4 结 论

秋眠型苜蓿Maverick叶片中CycD5;1基因的表达受温度极显著负调控、受日照长度极显著正调控，但温度对其表达调控占绝对优势；随着温度的降低CycD5;1基因表达上调，导致苜蓿叶面积的减小和株高的降低从而促进了苜蓿的秋眠。